0 조회수 • 5:00 분 • July 8th, 2025
관류된 쥐 해마 조각을 가져 가십시오.
파파인과 함께 배양하여 조직의 세포외 기질을 소화하고 뉴런, 성상세포 및 미세아교세포를 포함한 세포를 느슨하게 합니다.
DNase를 넣고 섞습니다.
단일 세포 현탁액을 얻기 위해 점진적으로 감소하는 직경의 피펫을 사용하여 조직을 기계적으로 해리시킵니다. 오염된 DNA를 분해하기 위해 DNase를 배양합니다.
스트레이너에 서스펜션을 통과시켜 파편을 제거합니다.
효소 활성을 멈추기 위해 2가 이온을 포함하는 완충액을 첨가하십시오.
원심분리하여 효소가 풍부한 상청액을 제거합니다.
이제 완충액과 항미엘린 마그네틱 비드를 추가합니다. 비드가 미엘린 파편을 결합하도록 배양합니다
.배양 후 원심분리하여 상청액을 제거합니다.
혼합물을 완충액에 재현탁하고 자기 분류기의 자기장에 배치된 강자성 구체가 포함된 자기 분리 컬럼에 로드합니다.
자기장은 미엘린이 없는 세포가 통과하는 동안 자기 비드에 결합된 미엘린 파편을 기둥에 유지합니다.
컬럼을 완충액으로 세척하고 뉴런, 성상세포 및 미세아교세포를 포함하는 흐름을 수집합니다.
멸균 면도날을 사용하여 성인 뇌 조직에서 수확한 각 샘플을 6웰 배양 플레이트의 뚜껑에 있는 작은 30-400mg 조각으로 다이싱하여 신경 해리를 시작합니다. 그런 다음 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS 1밀리리터에 조직을 담그고 피펫을 사용하여 샘플을 멸균 2밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
모든 조직을 수집하면 샘플을 원심분리하고 상청액을 흡인한 다음 샘플을 섭씨 37도 수조에서 15분 동안 배양하고 5분마다 튜브를 여러 번 뒤집어 침전된 조직 조각을 재현탁합니다.
배양이 끝나면 각 샘플에 새로 준비된 효소 혼합 튜브 30마이크로리터를 추가하고 튜브를 부드럽게 뒤집습니다. 그런 다음 1로 표시된 파스퇴르 피펫을 사용하여 기포가 발생하지 않도록 주의하면서 30회의 상하 분쇄로 각 샘플을 해리합니다. 5분마다 반전시켜 섭씨 37도에서 샘플을 15분 더 배양한 다음 방금 시연한 것처럼 파스퇴르 피펫 번호 2로 샘플을 해리합니다.
그런 다음 3번 피펫으로 전환합니다. 해리를 반복하고 샘플을 수조에서 10분 더 배양하고 5분마다 반전시킵니다. 배양이 끝나면 80미크론 세포 스트레이너를 통해 단일 세포 현탁액을 15밀리리터 팔콘 튜브로 여과하고, 각 스트레이너를 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS 10밀리리터로 세척하여 효소 반응을 중지합니다. 마지막 샘플이 여과되면 튜브를 회전시키고 상청액을 흡인합니다.
세포 현탁액에서 미엘린을 고갈시키려면 펠릿을 400마이크로리터의 미엘린 제거 완충액에 완전히 재현탁하고 각 튜브에 적절한 양의 미엘린 제거 비드를 추가합니다. 세포와 비드가 완전히 혼합될 때까지 용액을 위아래로 피펫팅합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 각 샘플을 5밀리리터의 미엘린 제거 완충액으로 세척합니다.
세포가 회전하는 동안 자기 분류기의 자기장에 각 샘플에 대해 하나의 컬럼을 배치하고 각 컬럼 위에 깨끗한 80미크론 필터를 배치합니다. 각 필터와 컬럼을 1밀리리터의 미엘린 제거 완충액으로 세 번 헹구고 모든 유동액을 폐기물 용기에 모으십시오.
최종 헹굼 후 각 컬럼 바로 아래에 5밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브를 놓아 용출액을 수집합니다. 그런 다음 샘플에서 상청액을 흡인하고 펠릿을 500마이크로리터의 미엘린 제거 완충액에 재현탁합니다.
즉시 세포 현탁액을 컬럼에 도포하고 아래 튜브에 세포를 수집합니다. 그런 다음 각 필터와 컬럼을 세척당 1밀리리터의 미엘린 제거 완충액으로 4회 헹구십시오. 마지막 세척 후 세포를 회전시키고 상청액을 흡인합니다.