Establishing Primary Mixed Glial Cell Cultures from a Mouse Spinal Cord

쥐 척수를 수확하여 조각으로 자릅니다.

단백질 분해 효소와 DNase가 들어 있는 튜브로 조각을 옮깁니다. 소용돌이와 인큐베이션.

효소는 조직의 세포외 기질을 소화하는 반면 DNase는 오염된 유리 DNA를 분해합니다.

다시 소용돌이치고 반복적으로 피펫팅하여 조직 해리를 완료하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

심분리하여 상층액을 제거합니다. DNase, 프로테아제 억제제 및 소용돌이를 포함하는 용액에 세포를 재현탁합니다. 억제제는 효소를 중화시킵니다.

신선한 억제제 용액을 위에 겹겹이 쌓고 원심분리한 후 상청액을 제거합니다.

밀도 구배 배지, 소용돌이에 세포를 재현탁한 다음 원심분리합니다.

세포는 바닥에 가라앉고 미엘린 파편은 상단에 남아 있습니다.

잔해물을 버리십시오. 완충액으로 반복적으로 세척하고 원심분리한 후 상청액을 제거합니다. 세포를 성장 배지에 재현탁합니다.

세포를 도금합니다. 코팅되지 않은 표면은 신경교세포 부착을 용이하게 합니다.

사용한 배지를 제거하고 새로운 배지를 추가하여 신경교세포 증식을 유도하여 혼합 신경교세포 배양을 확립합니다.

조직 배양 후드에서 작업하면서 4개의 마우스 척수를 HBSS의 페트리 접시로 옮깁니다. 멸균 가위와 겸자를 사용하여 각 척수를 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 파파인 DNase 효소 혼합물이 들어 있는 50밀리리터 원뿔형 튜브로 조각을 옮깁니다. HBSS를 효소 혼합물로 옮기면 효소의 성능이 저하될 수 있으므로

단일 세포 현탁액을 얻으려면 조직 조각이 잘 소화되는 것이 중요합니다. 그러나 과잉 소화는 생존 가능한 세포를 줄입니다. 각 실험실은 세포에 가장 적합한 것을 기반으로 정확한 소화 시간을 결정하기 위해 파일럿 테스트를 수행해야 합니다.

다음으로, 튜브를 부드럽게 소용돌이치게 한 다음 섭씨 37도에서 분당 150회전으로 궤도를 흔들면서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 튜브를 소용돌이치게 한 다음 5밀리리터 피펫을 사용하여 조직을 격렬하게 분쇄하여 추가 해리를 촉진합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 300배 g으로 원심분리합니다.

원심분리하는 동안 멸균 튜브에 있는 2.7밀리리터의 EBSS에 재구성된 알부민 오보뮤코이드 억제제 용액 300마이크로리터를 넣고 잘 혼합합니다. 그런 다음 150마이크로리터의 DNase 용액을 추가합니다. 원심분리 후, 상청액을 제거하고 새로 준비된 알부민 오보무코이드 억제제 및 DNase 용액에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포 펠릿을 깨기 위해 소용돌이가 잘 있습니다.

그런 다음 DNase가 없는 재구성된 알부민 오보무코이드 억제제 용액 3밀리리터를 세포 현탁액에 첨가합니다. 세포를 실온에서 6분 동안 70배 g으로 원심분리합니다. 스핀 후 막 조각이 포함된 상청액을 제거하고 펠릿을 유지합니다.

해리된 척수 세포에서 미엘린을 제거하려면 먼저 실온 20% 밀도 구배 배지 8밀리리터를 세포 펠릿이 들어 있는 튜브에 넣고 부드럽게 소용돌이치게 합니다. 다음으로, 세포를 800배 g으로 실온에서 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 대부분 미엘린을 포함하는 파편의 최상층과 펠릿을 떠나는 상청액을 조심스럽게 흡인합니다.

남아 있는 밀도 구배를 제거하려면 HBSS로 희석된 cDMEM 8밀리리터로 펠릿을 재현탁하여 세포를 세척합니다. 세포를 섭씨 4도에서 10분 동안 400g에서 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 이전과 같이 희석된 cDMEM으로 세포를 세척합니다.

상청액을 제거한 후 펠릿은 세포가 파종될 때까지 얼음 위에 보관할 수 있습니다. 도금 준비가 되면 2-메르캅토에탄올이 보충된 cDMEM 14밀리리터에 세포를 재현탁하고 12웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1밀리리터를 추가합니다.

웰당 평균 세포 수와 배양의 미세아교세포 함량을 결정하는 데 사용할 수 있는 여분의 웰을 플레이트합니다. 세포가 도금되면 세포를 섭씨 35.9도에서 5% 이산화탄소와 함께 배양합니다. 도금 다음날인 1일차에 배지를 교체하십시오.

일부 세포는 배양판에 부착되어 있지만 여전히 대부분 둥글다. 또한 많은 부유 셀과 상당한 잔해가 있습니다. 그 후 3-4일 후에 미디어 교체를 반복합니다.