이(Otic progenitor) 세포를 감각 상피 세포(sensory epithelial cell)로 분화한 후 면역염색(immunostaining)

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신경과학

0 조회수 • 3:55 분 • July 8th, 2025

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배지에서 불멸화된 다능성 이구구 세포(iMOP) 세포를 배양합니다.

배지의 성장 인자는 iMOP 증식과 콜로니 형성을 촉진하여 이권을 생성합니다.

이권을 모아서 중력에 의해 가라앉히십시오.

배지를 제거하고 성장 인자가 없는 미화 배지를 추가합니다. 이구를 플레이트합니다.

성장 인자가 없으면 iMOP가 감각 상피 세포로 분화되기 시작합니다.

분화된 이구를 모아 정착시키십시오.

배지를 제거하고 고정액을 추가하여 세포 형태를 보존합니다.

다음으로 세포막과 핵막을 투과화하기 위해 세제를 첨가합니다.

비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 완충액을 추가합니다.

특정 분화 마커를 표적으로 하는 1차 항체를 도입합니다.

1차 항체를 표적으로 하는 형광단 접합 2차 항체, 액틴을 염색하기 위해 형광 표지 팔로이딘, 핵을 염색하기 위해 DNA 결합 염료를 추가합니다.

이권을 장착합니다.

형광 현미경을 사용하여 염색을 시각화하여 iMOP 분화를 확인합니다.

도금 3일 후 중력 침전을 사용하여 앞서 살펴본 대로 이구를 수집합니다. 상청액을 흡인하고 세포를 감각 상피 분화 배지 2밀리리터에 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 10밀리리터 대구경 피펫을 사용하여 이구를 새로운 60밀리미터 접시로 옮깁니다. 10일 동안 이구를 분화하고 격일로 2밀리리터의 신선한 분화 배지를 배양액에 추가합니다.

그 후, 중력, 침전을 통해 이구를 다시 수확하고 사용한 배지를 흡인합니다. 다음으로, 이권을 실온에서 15분 동안 1X PBS의 4% 파라포름알데히드에 고정합니다. 그런 다음 포름알데히드 용액을 제거하고 0.1% Triton X-100을 함유한 1X PBS에서 세포를 세척합니다. 10% 염소 혈청과 0.1% Triton X-100을 보충한 1X PBS에서 이구를 차단하여 진행합니다.

1시간 후, 차단 완충액을 Cdkn1b 또는 Cdh1 항체의 적절한 희석액을 포함하는 것으로 교체합니다. 그런 다음, 1차 항체 중의 세포를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하고, 다음날, 다른 곳에서 설명한 바와 같이 형광 표지 2차 항체, 팔로이딘 및 Hoechst를 사용하여 면역염색을 계속합니다.

이미징을 준비하려면 유리 슬라이드 위에 마운팅 매체를 놓은 다음 염색된 이구를 배지에 도입합니다. 다음으로 샘플 위에 커버슬립을 놓습니다. 마운팅 매체를 섭씨 4도에서 밤새 건조시킨 후 슬라이드를 16비트 CCD 카메라가 장착된 도립 현미경의 스테이지에 놓습니다. 20X 0.75 공기 대물렌즈를 사용하여 파란색, 녹색, 빨간색 및 적외선 채널에서 데이터를 수집하여 낙후형광 이미지를 획득합니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026