불멸화된 다능성 귀 전구세포를 나선형 신경절 뉴런으로 분화시키고 분화 평가

세포 배양 기질로 코팅된 멸균 커버슬립이 포함된 멀티웰 플레이트를 가져 와십시오.

불멸화된 다능성 귀 전구 세포 또는 iMOP를 신경 분화 배지에 도입합니다.

iMOP는 청각 정보를 뇌에 전달하는 나선형 신경절 뉴런(SGN)을 포함한 다양한 내이 세포의 전구체입니다.

가 기질에 부착되도록 배양합니다. 배지는 iMOP를 SGN으로 분화하도록 유도합니다.

단백질 가교를 유도하고 세포 형태를 보존하는 고정제와 세포막을 투과화하는 세제 용액을 추가합니다.

비특이적 라벨링을 방지하기 위해 차단 시약을 도입합니다.

신경 분화 마커에 특이적인 형광단 접합 항체를 추가하고 배양하여 항체가 SGN을 표지할 수 있도록 합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하고 형광 핵 염색제가 포함된 마운팅 매체로 커버슬립을 장착합니다.

형광 현미경을 사용하여 항체 신호를 검출하여 iMOP가 SGN으로 분화되는 것을 확인합니다.

먼저 원형 유리 커버슬립을 멸균 100mm 플레이트에 넣고 70% 에탄올에 담가 청소합니다. 커버슬립을 부드럽게 저어서 덮었는지 확인하고 접시를 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 커버슬립을 멸균 1x PBS로 세 번 헹구고 멸균수로 한 번 헹굽니다.

그런 다음 커버슬립을 조직 배양 후드에서 UV 광선에 15분 동안 노출시켜 건조시킵니다. 즉시 사용하려면 멸균 커버슬립 1개를 24웰 플레이트의 각 웰에 넣고 플레이트를 부드럽게 흔들어 모든 커버슬립이 평평하게 놓이도록 합니다. 그런 다음 폴리-D-라이신 밀리리터당 10마이크로그램을 함유한 1x PBS 0.25밀리리터를 각 웰에 첨가하여 커버슬립을 코팅합니다.

플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양한 후, 폴리-D-라이신 용액을 제거하고 멸균 1x PBS로 웰을 3회 세척합니다. 마지막 세척의 액체가 흡인되면 밀리리터당 10마이크로그램의 라미닌을 함유한 1x PBS 0.25밀리리터를 24개의 웰 각각에 도입합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양한 후 라미닌 용액을 흡인합니다. 그런 다음 각 웰을 1밀리리터의 1x PBS로 세 번 세척하되 세포가 도금될 준비가 될 때까지 마지막 세척의 PBS를 웰에 그대로 둡니다.

뉴런 분화를 시작하려면 이전에 설명한 대로 해리된 이구에서 세포를 계산한 다음 예열된 뉴런 분화 배지에 재현탁합니다. 1 내지 1.5 x 10 5 iMOP 세포를 코팅된 커버슬립을 포함하는 플레이트의 각 웰에 파종하여 진행합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 배양하고 격일로 신경 분화 배지를 교체합니다.

7일 후, 배지를 흡인하고 커버슬립에 부착해야 하는 세포를 각 웰에 4% 포름알데히드를 첨가하고 실온에서 15분 동안 방치하여 고정합니다. 그런 다음 포름알데히드를 제거하고 0.1% Triton X-100을 함유한 1x PBS에서 세포를 한 번 세척합니다. 다음으로, 세척 완충액을 제거하고 10% 정상 염소 혈청과 0.1% Triton X-100을 함유하는 1x PBS로 구성된 차단 완충액을 각 웰에 추가합니다.

세포를 실온에서 1시간 동안 방치한 다음 액체를 제거하고 Cdkn1b 또는 Tubb3 항체의 적절한 희석액을 포함하는 차단 완충액으로 교체합니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 배양한 후, 1% Triton X-100을 함유한 1x PBS로 세포를 한 번 세척한 다음 앞서 설명한 대로 면역염색을 진행합니다. 염색이 완료된 후 웰에 1x PBS를 추가하여 최종 세척을 수행합니다.

분석을 위해 준비하려면 염색 세포가 부착된 커버슬립을 24웰 플레이트에서 제거하고 유리 슬라이드의 마운팅 매체 위에 놓습니다. 마운팅 매체를 섭씨 4도에서 밤새 건조시킨 후 앞서 설명한 대로 낙산화 형광 이미지를 획득합니다.