Transgenic Mouse Embryos의 안구 운동 절편의 Ex Vivo Culture and Imaging of Oculomotor Embryos

형질전환 임신한 쥐를 가져와 배아가 포함된 자궁을 외과적으로 분리하고 세척하여 잔여 혈액을 제거합니다.

형광 표지된 운동 뉴런을 포함하는 배아를 제거하고 멀티웰 플레이트의 뚜껑으로 옮깁니다.

용융된 아가로스를 첨가하고 뚜껑을 식혀 겔 형성을 유도하여 배아를 포매시킵니다.

형광 현미경으로 안구 운동 핵과 눈을 일직선으로 정렬하고 아가로스를 선과 평행하게 다듬습니다.

표본 단계에 배아를 고정하고 콜드 슬라이싱 완충액으로 채워진 진동 챔버에 넣습니다.

진동을 사용하여 안구 운동 핵과 눈을 포함하는 슬라이스를 생성합니다. 핵은 안구 운동을 제어하는 안구 운동 신경을 형성합니다.

슬라이스를 배양 배지가 들어 있는 멀티웰 플레이트 내부의 배양 인서트에 옮기고 배양합니다.

형광 현미경을 사용하여 일정한 간격으로 이미지를 촬영하여 축삭을 확장하여 눈에 도달하는 형광 표지된 안구 운동 뉴런을 관찰합니다.

절차를 시작하기 전에 먼저 시간 제한 짝짓기에서 배아 10.5일에 초음파로 임신을 확인합니다. 배아를 채취하고 임신한 쥐의 복부에 70% 에탄올을 뿌리고 가위를 사용하여 복강을 열어 자궁을 추출합니다. 얼음처럼 차가운 HBSS의 페트리 접시에서 자궁을 씻은 후 신선한 얼음처럼 차가운 HBSS의 두 번째 페트리 접시에 장기를 넣습니다.

해부 현미경으로 자궁 뿔과 개별 양막에서 배아를 제거하고 각 배아를 채취할 때 얼음 위의 12웰 플레이트 뚜껑 아래쪽에 놓습니다. 여과지를 사용하여 배아 자체를 건드리지 않고 각 배아를 둘러싼 액체를 제거하고 배아를 액체 4% 저융점 아가로스에 담급니다.

접시 뚜껑을 얼음 위에 올려 아가로스를 응고시킵니다. 아가로스가 굳으면 배아를 뒤집고 각 샘플의 반대쪽을 추가 아가로스로 덮습니다. 두 번째 부피의 아가로스가 응고되면 형광 해부 현미경을 사용하여 각 배아 주위의 아가로스를 다듬어 각 배아가 비브라톰 단계에서 적절하게 방향을 잡도록 합니다.

안구 운동 핵과 초기 축삭 성장은 형광을 발해야 합니다. 핵, 나가는 축삭 및 눈이 선을 형성하도록 각 배아를 정렬하고 면도날을 사용하여 이 선과 평행하게 아가로스를 다듬습니다. 다음으로, 비브라톰 챔버에 얼음처럼 차가운 슬라이스 버퍼를 채우고 블레이드가 안구 운동 핵 및 눈과 평행이 되도록 첫 번째 배아를 비브라톰 단계에 강력 접착제

로 붙입니다.

슈퍼 글루가 마르면 배아가 블레이드에서 반대쪽을 향하도록 비브라톤 단계를 담그고 새로운 비브라톤 블레이드를 사용하