0 조회수 • 3:15 분 • July 8th, 2025
세포 생존을 촉진하는 Rho-키나제 억제제가 함유된 배지에서 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함하는 멀티웰 플레이트로 시작합니다.
배지를 영양소와 성장 인자가 포함된 필수 배지로 교체하십시오.
iPSC가 전구체 세포로 증식 및 분화될 수 있도록 배양합니다.
이 배지를 섬유아세포 성장 인자와 레티노산이 보충된 분화 배지로 교체한 다음 배양합니다.
성장 인자는 전구체 세포가 미세혈관 내피 세포로 분화되는 것을 촉진하는 반면, 레티노산은 밀착 접합 단백질의 합성을 촉진합니다.
세포를 세척하고 효소-EDTA 용액으로 처리하여 세포를 분리하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다.
원심분리하여 세포를 수집하고 상청액을 제거합니다. 그런 다음 세포를 신선한 분화 배지에 재현탁합니다.
이 세포 현탁액을 콜라겐 및 접착 단백질로 코팅된 멀티웰 플레이트에 시드합니다.
세포 접착을 허용하기 위해 배양하여 뇌 미세혈관 내피 세포와 유사한 세포 사이에 긴밀한 접합을 형성합니다.
인간 iPSC로부터 BMEC 분화를 유도하기 위해, 합류 iPSC 배양을 DPBS로 한 번 세척한 후 섭씨 37도에서 약 5분 동안 적절한 부피의 효소 EDTA와 함께 세포를 배양합니다.
단일 세포 현탁액이 얻어지면 원심분리에 의해 세포를 수집하고 계산을 위해 10마이크로몰 ROCK 억제제를 보충한 적절한 부피의 줄기 세포 배지에 펠릿을 재현탁합니다.
세포를 입방 센티미터 농도당 1.56배 10에서 4번째 세포로 희석하고 2밀리리터의 세포를 6웰 평평한 바닥의 개별 웰에 시드합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 후, 각 웰의 상청액을 E6 배지로 교체하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 4일 더 합니다.
iPSC 유래 BMEC를 정제하려면 웰당 적절하게 준비된 콜라겐 IV 및 피브로넥틴 용액으로 계대 배양 플레이트를 코팅하고 섭씨 37도에서 최소 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.
분화 6일째에 원심분리에 의해 세포를 수집하고 B27, 염기성 섬유아세포 성장 인자 및 레티노산이 보충된 신선한 인간 내피 무혈청 배지의 적절한 부피에 펠릿을 재현탁합니다. 콜라겐 및 피브로넥틴 코팅된 24웰 평평한 바닥 플레이트의 각 웰에 세포를 플레이트합니다.