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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
다공성 멤브레인으로 분리된 중첩된 매트릭스 코팅 채널이 있는 미세유체 칩을 예로 들어 보겠습니다.
상부 채널에 iPSC 유래 신경 전구 세포를 시드합니다. 세포 접착을 위해 배양한 다음 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 세척합니다.
다음으로, iPSC 유래 뇌 미세혈관 내피 세포를 하단 채널에 시드합니다.
칩을 뒤집고 배양하여 내피 세포를 하단 채널의 막 쪽에 부착합니다.
다음으로, 칩을 뒤집어 채널의 아래쪽에 세포를 부착하여 단층 튜브와 같은 구조를 형성합니다. 세포 특이적 배지로 두 채널을 모두 세척합니다.
상부 채널에 신경 분화 배지를, 하부 채널에 내피 세포 배지를 지속적으로 흐르게 합니다.
내피 세포는 배지의 성장 인자를 활용하여 성숙하고 혈관과 유사한 긴밀한 접합을 형성하여 혈액 측면을 형성합니다.
신경영양인자는 신경 전구 세포를 다양한 뇌 세포로 분화시켜 뇌 측을 형성합니다. 이 세포는 내피 세포와 상호 작용하여 칩에 혈액-뇌 장벽을 만듭니다.
시작하려면 준비된 칩이 들어 있는 접시를 생물 안전 캐비닛으로 가져옵니다. P200 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 신경 분화 배지를 입구에 추가하고 출구에서 액체를 당겨 두 채널을 부드럽게 세척합니다. 포트와의 접촉을 피하고 칩 표면에서 과도한 미디어 방울을 조심스럽게 흡인하십시오.
균질한 세포 현탁액을 보장하기 위해 세포 현탁액을 부드럽게 교반합니다. iPSC 유래 신경 전구 세포를 상단 채널에 파종하여 뇌 측을 생성하려면 밀리리터당 1 x 106 세포의 농도로 30 내지 100마이크로리터의 세포 현탁액을 포함하는 P200 팁을 상단 채널 입구에 추가하고 피펫에서 팁을 부드럽게 풀어줍니다.
빈 P200 피펫을 가져와 플런저를 누르고 상단 채널 배출구에 삽입한 다음 팁을 통해 단일 셀 현탁액을 조심스럽게 당깁니다. 칩을 현미경으로 옮겨 상단 채널 내 세포의 균일한 분포에서 파종 밀도를 확인합니다. 20% 커버리지에서 세포 밀도를 확인한 후 즉시 칩을 섭씨 37도에서 2시간 동안 인큐베이터에 넣습니다.
그 후, 신선한 신경 분화 배지를 입구에 넣고 출구에서 피펫으로 액체를 모아 부착되지 않은 세포를 씻어냅니다. 매일 신경 분화 배지를 교체하여 세포를 섭씨 37도의 정적 조건으로 유지합니다. iNPC가 부착된 후 또는 파종 다음 날에 준비된 칩이 들어 있는 접시를 생물 안전 캐비닛으로 가져옵니다. 200마이크로리터의 내피 세포 배지로 하단 채널을 부드럽게 세척합니다.
포트와의 접촉을 피하고 칩 표면에서 과도한 내피 세포 배지의 방울을 조심스럽게 흡인하고 두 채널 모두에 배지를 남겨두십시오. 균질한 세포 현탁액을 보장하기 위해 세포 현탁액을 부드럽게 교반합니다. P200 피펫을 사용하여 30 내지 100 마이크로리터의 iPSC 유래 뇌 미세혈관 내피 세포 현탁액을 밀리리터당 14 내지 20 x 106 세포의 농도로 끌어올리고, 팁을 하단 채널 입구에 넣는다.
기능적 장벽 특성을 달성하기 위한 가장 중요한 단계는 뇌 미세혈관 내피 세포의 파종입니다. 장기초 내의 균일한 분포를 확인하기 위해 기포 형성을 피하기 위해 적절한 밀도로 세포를 파종하는 것이 중요합니다.
팁이 빈 P200 피펫의 플런저를 누르고 하단 채널 배출구에 삽입한 다음 피펫 플런저를 천천히 풀어 하단 채널을 통해 단일 셀 현탁액을 조심스럽게 당깁니다. 칩 표면에서 과도한 세포 현탁액을 흡인합니다. 입구 및 출구 포트와의 직접적인 접촉을 피하여 세포 현탁액이 채널 밖으로 흡입되지 않도록 하십시오. 칩을 현미경으로 옮겨 파종 밀도를 확인합니다.
하단 채널은 그 사이에 관찰할 수 있는 간격이 없는 셀로 채워져 있습니다. 올바른 세포 밀도를 확인한 후 나머지 칩에 세포를 시드합니다. 하단 채널 상단에 위치한 다공성 멤브레인에 셀을 부착하려면 각 칩을 뒤집어 칩 크래들에 놓습니다. 세포에 습도를 제공하기 위해 멸균 DPBS가 들어 있는 작은 저장소를 150mm 접시 안에 놓습니다.
칩을 섭씨 37도에서 약 3시간 동안 또는 하단 채널의 세포가 부착될 때까지 배양합니다. iPSC 유래 뇌 미세혈관 내피 세포가 부착되면 칩을 다시 수직 위치로 되돌려 세포가 하단 채널의 하단 부분에 부착될 수 있도록 합니다. iPSC 유래 뇌 미세혈관 내피 세포의 파종 후 48시간, 섭씨 37도의 수조에서 1시간 동안 데워 내피 세포 배지의 온도를 평형화합니다.
그런 다음 진공 구동 여과 시스템에서 15분 동안 배양하여 배지를 탈기합니다. 그런 다음 휴대용 모듈 포장 및 트레이의 외부를 70% 에탄올로 소독하고 닦은 후 생물안전 캐비닛으로 옮깁니다. 패키지를 열고 모듈을 트레이에 넣습니다. 물통이 트레이 뒤쪽을 향하도록 방향을 잡습니다. 사전 평형화된 따뜻한 배지 3밀리리터를 각 입구 저장소에 피펫팅합니다. 내피 세포 배양 배지를 하단 채널의 입구 저장소에 추가하고 신경 분화 배지를 상단 채널의 상단 채널 입구 저장소에 추가합니다.
그런 다음 사전 평형화된 따뜻한 배지 300마이크로리터를 각 출구 포트 바로 위의 각 출구 저장소에 피펫팅합니다. 각 트레이에 최대 6개의 휴대용 모듈을 배치합니다. 트레이를 인큐베이터로 가져오고 트레이 핸들이 바깥쪽을 향하도록 배양 모듈에 완전히 밀어 넣습니다. 문화권 모듈에서 프라임 주기를 선택하고 실행합니다. 인큐베이터 도어를 닫고 배양 모듈이 휴대용 모듈을 약 1분 동안 프라이밍하도록 합니다.
프라이밍 주기는 상태 표시줄에 "준비"가 표시되면 완료됩니다. 배양 모듈에서 트레이를 제거하고 생물 안전 캐비닛으로 가져옵니다. 생물 안전 캐비닛에 있는 각 휴대용 모듈의 밑면을 검사하여 휴대용 모듈이 성공적으로 프라이밍되었는지 확인합니다. 4개의 포트 모두에 작은 물방울이 있는지 확인하십시오. 휴대용 모듈에 물방울이 표시되지 않으면 해당 모듈에서 프라임 사이클을 다시 실행하십시오. 배출구 포트에서 더 자주 발생하는 용지가 트레이에 떨어지는 경우 70% 에탄올로 트레이를 청소하십시오.
다음으로, 각 칩의 두 채널을 따뜻한 평형 세포 특이적 배양 배지로 부드럽게 세척하여 채널에서 발생할 수 있는 기포를 제거하고 각 입구 및 출구 포트 상단에 작은 배지 방울을 놓습니다. 캐리어가 있는 칩을 휴대용 모듈에 삽입하고 각 트레이에 최대 6개를 배치합니다. 트레이를 배양 모듈에 삽입합니다. 배양 모듈에서 유속 및 스트레칭과 같은 적절한 장기 칩 배양 조건을 프로그래밍합니다. 약 2시간이 소요되는 조절 주기가 완료되자마자 프로그래밍된 조건이 시작됩니다. 그 후, 배양 모듈은 미리 설정된 장기-칩 배양 조건에서 흐름을 시작합니다.