Isolation and Culturing of Cells from Mouse Embryo Dorsolateral Telencephalons(쥐 배아에서 세포 분리 및 배양)

완충액에 있는 마우스 배아를 가져와 두개골을 분리하여 뇌를 분리합니다.

뇌를 덮고 있는 막층인 수막을 제거합니다.

반구를 분리하기 위해 뇌를 해부합니다.

구에서 배외측 종뇌를 분리하여 튜브로 옮깁니다.

배외측 종뇌는 뉴런과 신경 전구 세포가 풍부합니다.

심분리하여 상층액을 제거합니다.

효소 용액을 추가합니다. 효소는 조직 기질을 분해하여 세포를 느슨하게 합니다.

혈청을 함유한 증식 배지를 도입합니다. 혈청 단백질은 효소 활성을 억제합니다.

피펫을 사용하여 조직을 기계적으로 해리시켜 세포 현탁액을 형성합니다.

원심분리하여 비활성화된 효소와 조직 파편을 포함하는 상청액을 제거합니다.

증식 배지에 세포를 재현탁합니다.

세포를 세포 배양 기질로 코팅된 마이크로플레이트로 옮깁니다.

세포가 기질에 부착되도록 배양합니다. 배지는 전구세포 증식을 촉진합니다.

차가운 해부 배지가 있는 페트리 접시에서 5-10개의 E14 배아에서 뇌를 제거하는 것으로 시작합니다. 집게를 사용하여 피부와 두개골을 조심스럽게 빼내고 뇌를 분리합니다. 입체 현미경으로 작업하는 동안 해부 겸자를 사용하여 수막을 제거합니다. 그런 다음 중간에 있는 종뇌를 분할하여 반구를 분리합니다.

외측 말뇌를 분리하기 위해 배측 곡선과 pallial-suballial 경계를 따라 절단됩니다. 모든 뇌가 해부될 때까지 배외측 종뇌를 얼음 위의 해부 배지가 있는 2밀리리터 튜브로 옮깁니다. 배외측 종뇌의 미세 해부 후 조직을 15밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다.

그런 다음 수집된 조직과 저온 해부 배지가 들어 있는 튜브를 섭씨 4도, 340배 g에서 5분 동안 원심분리하여 조직을 침전시킵니다. 탈수 후 피펫으로 상청액을 제거하고 화학적 소화를 위해 섭씨 37도 0.05% 트립신-EDTA 1밀리리터를 첨가합니다. 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후, 트립신 활성을 억제하기 위해 증식 배지 2밀리리터를 첨가합니다. 그런 다음 가스 버너 또는 분젠 버너 위에서 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 몇 초 동안 연마하여 구멍을 약간 좁힙니다. FCS를 흡인하여 피펫 끝을 코팅합니다. 그런 다음 기포가 발생하지 않도록 주의하면서 위아래로 피펫팅하여 불 연마 및 FCS 코팅 파스퇴르 피펫으로 세포를 기계적으로 해리시킵니다.

해리된 세포를 섭씨 4도, g의 340배에서 5분 동안 원심분리한다. 피펫으로 상청액을 제거한다. 그런 다음 증식 배지 1밀리리터를 추가하고 피펫을 사용하여 세포를 재현탁합니다. 폴리-D-라이신으로 전처리된 플레이트에서 PBS를 제거합니다. 그런 다음 영점을 결정하기 위한 참조로 사용할 수 있는 판 바닥에 기호를 그립니다.

세포를 증식 배지에 두 번째로 재현탁한 후, 0.4% 트리판 블루 용액을 사용하여 세포 현탁액의 1:1 희석액을 준비합니다. 계수 챔버 슬라이드에 로드하고 염색되지 않은 생존 세포의 수를 계산합니다. 생존할 수 없는 세포는 파란색이 됩니다. 증식 배지에서 세포를 희석하여 밀리리터당 10⁶ 세포를 얻습니다. 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 세포를 배양합니다.