1차 마우스 중뇌 뉴런을 조작된 아데노 관련 바이러스로 감염

커버슬립에서 배아 마우스 중뇌 세포 배양으로 시작합니다.

뉴런 특이적 프로모터 하에서 형광 칼슘 지표 복합체를 암호화하는 조작된 아데노 관련 바이러스로 치료합니다.

바이러스 부착 및 내재화를 위해 배양합니다.

배지를 제거하여 결합되지 않은 바이러스를 제거한 다음 배양 배지를 추가하고 배양합니다.

내재화된 바이러스는 핵에서 게놈을 방출하며, 여기서 뉴런 특이적 프로모터는 일차 뉴런에서만 칼슘 지표 복합체의 생성을 유도합니다.

이러한 복합체는 칼슘 결합 단백질과 M13 펩타이드로 태그된 형광 단백질을 포함합니다.

커버슬립을 칼슘 이온이 풍부한 기록 완충액이 있는 접시에 옮긴 다음 실시간 공초점 이미징을 위해 기록 챔버에 넣습니다.

글루타메이트 기록 완충액을 도입하여 글루타메이트가 이온 채널과 결합하여 칼슘 이온이 유입되도록 합니다.

이 이온 은 복합체에 결합하여 구조적 변화와 형광 방출을 일으

라이브 이미징에서 밝은 뉴런은 바이러스 감염을 나타냅니다.

접시당 1마이크로리터의 hSyn-GCaMP6f AAV와 함께 1밀리리터의 무혈청 DMEM 배지를 준비하는 것으로 시작합니다. 각 접시에서 세포 배양 배지를 흡인하고 hSyn-GCaMP6f로 준비된 DMEM 1밀리리터로 교체합니다. 접시를 섭씨 37도 인큐베이터에 다시 1시간 동안 넣습니다.

배양 후 배지를 AAV로 흡인하고 3밀리리터의 세포 배양 배지로 교체합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5-7일 동안 배양하고 바이러스 감염 기간 동안 2-3일마다 배지를 교체합니다.

원고 지시에 따라 HEPES 기록 완충액 1리터, 200마이크로몰 글루타메이트 기록 완충액 200밀리리터, 10마이크로몰 NBQX 기록 완충액 200밀리리터를 준비합니다.

멸균 35mm 페트리 접시에 3밀리리터의 기록 완충액을 채웁니다. 인큐베이터에서 감염된 배양균과 함께 페트리 접시를 가져옵니다. 그런 다음 끝이 가는 집게로 커버슬립 한 개의 가장자리를 조심스럽게 잡고 기록 버퍼가 있는 접시에 옮깁니다.

나머지 커버슬립을 배지에 다시 섭씨 37도 인큐베이터에 넣고 기록 완충액이 있는 접시를 공초점 현미경으로 운반합니다. 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 초기화하는 동안 연동 펌프를 시작하고 라인을 기록 버퍼에 넣습니다. 그런 다음 유량을 분당 2밀리리터로 보정합니다.

미세한 집게를 사용하여 페트리 접시에서 기록조로 감염된 커버슬립을 옮깁니다. 10x 수침 대물렌즈와 명시야광을 사용하여 초점면을 찾고 뉴런 세포체의 밀도가 높은 영역을 찾습니다. 그런 다음 40x 대물렌즈로 전환하고 샘플의 초점을 다시 맞춥니다.

염료 목록 창에서 AlexaFluor 488을 선택하여 적용합니다. 형광단의 과다 노출 및 광표백을 방지하려면 낮은 HV 및 레이저 출력 설정으로 시작하십시오.

AlexaFluor 488 채널의 경우 HV를 500으로, 게인을 1x로, 오프셋을 0으로 설정합니다. 5 레이저 라인의 출력을 488%로 설정합니다. 핀홀 크기를 300마이크로미터로 늘리고 "초점 x2" 스캐닝 옵션을 사용하여 방출 신호를 과포화 수준으로 최적으로 조정합니다. 그런 다음 각 채널의 최적 가시성을 위해 설정을 조정할 수 있습니다.

현미경 설정이 최적화되면 스테이지를 이동하여 GCaMP6f 형광의 자발적인 변화를 나타내는 여러 세포가 있는 영역을 찾고 이미징을 위해 원하는 평면에 초점을 맞춥니다.

"Clip rect" 도구를 사용하여 1초 미만의 프레임 간격을 달성할 수 있는 크기로 이미징 프레임을 클리핑합니다. 간격 창을 1.0 값으로 설정하고 num 창을 600으로 설정합니다.

T-시리즈 영화를 캡처하려면 "시간" 옵션을 선택하세요. 그런 다음 "XYt" 스캔 옵션을 사용하여 이미징을 시작합니다. 이미징 진행률 표시줄을 보고 적절한 시점에서 HEPES 기록 완충액에서 20마이크로몰 글루타메이트 기록 완충액으로 라인을 이동합니다.

이미징이 완료되면 "시리즈 완료" 버튼을 선택하고 완성된 t-시리즈 동영상을 저장합니다. 배양된 뉴런이 총 10분 동안 글루타메이트에 노출되도록 추가로 5분 동안 글루타메이트를 계속 관류합니다. 이미지화할 각 커버슬립에 대해 이 과정을 반복합니다.