감각 뉴런 분리 및 자연 살해 세포와의 공동 배양

후근 신경절 또는 DRG(감각 뉴런 클러스터)를 차가운 혈청 함유 배지에 담아 후속 처리 중에 뉴런을 보호합니다.

원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.

소화 효소가 포함된 인산염 완충액을 첨가하고 약한 교반과 함께 배양합니다.

효소는 세포외 기질(ECM)과 DRG 조직을 해리시켜 세포를 느슨하게 합니다.

효소를 비활성화하기 위해 혈청 함유 배지를 첨가하십시오.

원심분리한 다음 상층액을 버립니다.

DRG를 재현탁하고 점진적으로 더 작은 크기의 피펫을 사용하여 조직을 기계적으로 해리하여 세포 현탁액을 얻습니다.

소 혈청 알부민의 밀도 구배에 세포를 층층으로 층입니다.

원심 분리기. 뉴런은 바닥에 가라앉아 펠릿을 형성합니다.

조직 파편이 포함된 층을 버립니다.

뉴런을 배양 배지에 재현탁합니다.

뉴런을 ECM 코팅 배양 접시에 추가하고 배양합니다.

배지를 제거하고 자연 살해 또는 NK 세포를 추가합니다.

공동 배양에 배지를 추가하고 이러한 세포 간의 상호 작용을 연구합니다.

DRG를 10밀리리터의 얼음처럼 차갑고 보충된 DMEM으로 채워진 15밀리리터 원추형 튜브에 수확합니다. 그런 다음 제제를 실온에서 200g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거합니다. 콜라게나제 IV 밀리리터당 1밀리그램과 밀리리터당 2.4단위의 분산효소를 함유한 PBS 250마이크로리터를 추가합니다. 이 DRG를 콜라게나제 분산효소 용액과 함께 80분 동안 약하게 교반하면서 배양합니다.

효소를 비활성화하려면 보충된 DMEM 배지 5밀리리터를 추가하고 용액을 200g으로 원심분리합니다. 5분 후 피펫을 사용하여 상청액을 부드럽게 제거하고 원치 않는 세포 손실을 방지하기 위해 약 100마이크로리터의 상청액을 남겨 둡니다. 다음으로, 1밀리리터 보충된 DMEM을 세포에 추가하고 피펫 건과 크기가 감소하는 유리 파스퇴르 피펫 3개를 사용하여 DRG를 단일 세포 제제로 부드럽게 분쇄합니다.

P200 피펫을 사용하여 뉴런을 포함하는 분쇄된 신경절 현탁액을 튜브 측면에 BSA 구배에 추가합니다. 그런 다음 가속 및 감속을 최소로 설정하여 BSA 구배를 포함하는 뉴런을 200g에서 12분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 피펫을 사용하여 모든 상청액을 제거하고 세포를 500마이크로리터의 신경기저에 재현탁합니다.

라미닌 코팅된 평평한 바닥 96웰 플레이트에 웰당 10,000개의 뉴런을 플레이트합니다. 뉴런의 부착을 허용하려면 96웰 플레이트를 섭씨 37도