인간 각막 섬유아세포와 뉴런의 3D 공동 배양 모델 생성

인간 각막 섬유아세포를 예로 들어 보겠습니다.

배지가 들어 있는 멀티웰 플레이트 내의 멤브레인 인서트로 옮깁니다.

멤브레인 삽입물에 매체를 추가합니다. 인서트에 대한 섬유아세포 부착을 위해 배양합니다.

그런 다음 멤브레인 삽입물과 저장소에 비타민 C가 포함된 배지로 배지를 교체합니다.

인큐베이트. 비타민 C는 섬유아세포를 자극하여 3D 세포외 기질을 분비하고 조립합니다.

섬유아세포 위에 인간 신경모세포종 세포 현탁액을 추가합니다.

배

양하여 신경모세포종 세포 부착을 허용합니다.

이제 세포 위에 레티노산이 함유된 배지를 추가하고 저장소에 신선한 배지를 보충합니다.

인큐베이트. 레티노산은 신경모세포종 세포를 신경 전구 세포로 분화시킵니다.

그런 다음 미디어를 제거합니다. 저장소에 신선한 배지를 도입합니다. 신경영양 인자를 포함하는 배지를 멤브레인 삽입물에 추가하고 배양합니다.

신경영양 인자는 전구세포를 뉴런으로 분화시켜 인간 각막 섬유아세포와 뉴런의 3D 공동 배양 모델을 생성합니다.

3D 구조물을 조립하려면 먼저 인간 각막 섬유아세포를 계대하고 계산합니다. 그런 다음 0.4미크론 기공이 있는 폴리카보네이트 멤브레인 인서트에 6개의 HCF에 약 10배 10을 시드합니다. 구조물 상단에 1.5밀리리터의 신선한 배지를 추가합니다. 그런 다음 동일한 배지 1.5밀리리터를 각 구조물의 바닥에 피펫팅합니다.

24시간 후, 0.5밀리몰 비타민 C가 보충된 배지 1.5밀리리터를 각 구조물의 상단과 하단에 첨가합니다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에 3주 동안 배양하고 격일로 비타민 C가 함유된 신선한 배지를 추가합니다. 이것은 세포가 자신의 세포외 기질을 분비하고 조립하도록 자극합니다. 3주 후, 이전에 조립된 3D 구조물 위에 있는 3개의 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에 8 x 10을 추가합니다.

이 단계에서 정확한 세포 수를 계산하고 세포 분화를 시작하기 전에 24시간을 허용하는 것이 중요합니다.

배양 24시간 후, 10% FBS 및 10마이크로몰 레티노산이 포함된 1.5밀리리터의 EMEM으로 세포를 자극하여 SH-SY5Y 세포 분화를 시작합니다. 그런 다음 비타민 C를 함유한 배지 1.5밀리리터를 구조물의 바닥에 첨가합니다. 레티노산은 빛에 민감하므로 이 단계는 어둠 속에서 수행해야 합니다.

5일 후, 세포가 분화 단계에 도달하면 2나노몰 BDNF와 1% 항생제-항진균제를 함유하는 무혈청 배지 1.5밀리리터를 구축물 상단에 첨가합니다. 신선한 비타민 C 보충 배지를 구조물의 바닥에 첨가하십시오. 추가 분석을 위해 처리하기 전에 추가로 2일 동안 세포를 배양합니다.