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코팅된 커버슬립에서 배양된 제브라피쉬 망막 신경절 세포를 취하십시오.
이 세포는 과산화수소 민감성 효소인 Orp1에 융합된 산화환원 민감성 녹색 형광 단백질 roGFP2를 생성하는 유전적으로 암호화된 바이오센서를 발현합니다.
배지가 포함된 커버슬립을 살아있는 세포 이미징 챔버로 옮기고 챔버를 도립 현미경에 놓습니다.
배경 형광을 줄이기 위해 배지를 무혈청 배지로 교체하십시오.
낮은 과산화수소 수준으로 인해 roGFP2는 환원된 형태로 유지됩니다.
바이오센서를 405nm 및 480nm 파장에서 순차적으로 여기시킵니다.
환원된 roGFP2는 480nm에서 여기 피크를 나타냅니다.
과산화수소 함유 매체로 전환합니다.
과산화수소는 세포에 들어가 Orp1과 반응하여 roGFP2를 산화시킵니다.
바이오센서를 다시 자극합니다.
산화된 roGFP2는 405nm에서 형광 증가와 480nm에서 감소를 나타냅니다.
형광 강도 비율을 계산합니다.
비율의 증가는 세포 과산화수소 수치가 증가했음을 나타냅니다.
이미징 당일 현미경으로 세포를 확인하여 RGC 축삭의 성장을 확인합니다. 살아있는 세포 이미징의 경우, 배양 접시에서 살아있는 세포 이미징 챔버로 커버슬립을 옮깁니다. DIC 대물렌즈, OG590 롱패스 적색 필터 및 EM-CCD 카메라가 장착된 도립 현미경을 사용하십시오.
이미징하기 전에 ZFCM+ 배지를 ZFCM-으로 교체하십시오. 10x 대물렌즈로 셀을 배치한 후 오일 이지전 대물렌즈를 사용하여 60x 배율로 이미지를 획득합니다. 추가 1.5배 배율을 사용합니다.
먼저 DIC 이미지를 획득한 다음 적절한 필터 세트를 사용하여 roGFP2-Orp1을 이미지화합니다. 첫 번째 이미지 세트를 촬영한 후 다른 처리 용액이 포함된 미디어와 미디어를 교환합니다. pH 및 삼투압 변화를 피하기 위해 이미징 30분마다 배지를 교체해야 합니다.