Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

JoVE Encyclopedia of Experiments

신경과학

0 조회수 • 4:05 분 • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

플랫 마운트 마우스 망막을 기록 챔버 내의 생리학적 용액에 넣습니다.

현미경을 사용하여 기록 피펫을 망막 위에 놓습니다. 피펫에는 전극이 포함되어 있으며 내부 용액으로 채워져 있습니다.

피펫이 막히는 것을 방지하기 위해 양압을 가하고 망막에 삽입한 다음 조직 손상을 방지하기 위해 압력을 줄입니다.

다른 뉴런과 시냅스적으로 연결된 스타버스트 무축삭 세포(SAC)를 향해 피펫을 전진시킵니다.

막에 보조개가 형성될 때까지 세포에 접근합니다. 압력을 풀어 멤브레인이 팁에 달라붙도록 합니다.

음의 전류를 사용하여 멤브레인 패치를 피펫으로 끌어당깁니다.

흡입을 가하여 막을 파열시켜 전극과 세포 세포질 사이의 연속성을 확립하는데, 이를 전체 세포 패치 클램프라고 합니다.

시냅스 전류를 기록하려면 전압을 가하여 SAC의 막 전위를 일정하게 유지하십시오.

시냅스로 연결된 뉴런에 의해 방출되는 신경 전달 물질은 전극으로 측정된 SAC 시냅스 수용체를 통해 이온 흐름을 유발합니다.

이 절차에서는 주사기 필터를 통해 내부 용액을 맞춤형 백필 필라멘트로 필터링합니다. 그런 다음 필라멘트를 새로 당긴 마이크로피펫에 삽입하고 용액이 은 전극 와이어를 5mm 이상 덮을 때까지 팁 근처에 내부 용액을 분배합니다. 그런 다음 마이크로피펫을 흡입 극이 있는 전극 홀더에 고정하고, 이를 통해 튜브로 연결된 10밀리리터 플라스틱 주사기의 플런저를 밀거나 당겨 전극 내부의 압력을 조정할 수 있습니다.

그런 다음 대물렌즈 아래에 있는 피펫을 찾아 망막 위 약 100마이크로미터까지 내립니다. 전류 팔로워 모드에서 DC 오프셋을 사용하여 정지 DC 전압 신호를 0으로 설정합니다. 수조에 있는 동안 피펫을 통해 고정 진폭 구형파 전류를 주입하여 전류 클램프 모드에서 피펫 저항을 측정합니다. R 액세스 노브를 돌려 차이를 중화하고 판독값을 사용하여 피펫 저항을 계산합니다.

그런 다음 천천히 전극을 망막 위 약 10마이크로미터로 가져옵니다. 전극에 양압을 가합니다. 그런 다음 피펫 팁이 망막에 접근할 때 반사가 변하는 것을 관찰하십시오.

빠르고 부드럽게 피펫을 GCL에 밀어 넣고 즉시 양압을 낮춥니다. 피펫을 표지된 뉴런 쪽으로 이동하고 다른 뉴런, 혈관 및 뮬러 세포의 끝 발에 접촉하지 마십시오. 전극 막힘을 방지하기 위해 필요한 경우 더 많은 양압을 가하십시오.

그런 다음 보조개가 보일 때까지 표지된 뉴런 근처에 피펫 팁을 놓습니다. 그런 다음 양압을 해제하고 원형질막이 피펫 팁으로 다시 튕겨 나오도록 합니다. 기가옴 씰의 형성을 돕기 위해 피펫에 20-120피코암페어 음전류를 가합니다.

양압을 해제한 후 세포막이 다시 튕겨 나오도록 하는 것은 기록 후 세포 형태를 보존하기 위해 막과 피펫 개구부 사이에 자연적으로 형성되는 우수한 밀봉이 중요하기 때문에 중요합니다.

필요한 경우 부드럽게 흡입하여 원형질막을 피펫 안으로 당깁니다. 봉인 형성 후 5분 동안 세포막이 파열되어 과융합을 통해 흘러내린 내부 용액을 제거할 수 있도록 합니다. 멤브레인이 파열된 후 현재 cl에 있는 동안 amp 모드에서 브리지 밸런스를 켜고 R축 노브를 사용하여 조정합니다. 세포를 반전 전위로 유지하여 전압 클램프 모드에서 흥분성 및 억제성 시냅스 후 전류를 기록합니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026