제브라피시 배아에서 운동 뉴런의 전기생리학을 연구하기 위한 비침습적 접근 방식

유전자 조작 제브라피쉬 배아를 입체 현미경 아래에 놓고 척수 운동 뉴런에 의해 유발되는 자발적인 꼬리 코일링을 관찰합니다.

이러한 뉴런의 고유한 특성은 나트륨 채널을 통해 이온 유입을 유발하여 자발적인 막 탈분극과 근육으로 전파되는 활동 전위를 생성하여 꼬리 코일링을 유발합니다. 코일링 주파수를 측정합니다.

일부 배아를 나트륨 채널 차단제로 이식하여 나트륨 유입을 억제하고 감소된 코일링 빈도를 평가합니다.

용융된 아가로스에 처리되지 않은 배아를 장착합니다. 아가로스를 응고시켜 움직임을 제한하고 형광 현미경으로 관찰합니다.

운동 뉴런은 기증자 및 수용체 형광단에 융합된 막 결합 전압 감지 도메인(VSD)을 가진 바이오센서를 발현합니다.

탈분극은 VSD 형태를 변화시켜 형광단을 더 가깝게 만듭니다.

여기되면 기증자는 에너지를 수용체로 전달하여 수용체 형광 방출을 유발합니다.

차단제를 첨가하여 탈분극을 억제하여 수용체 방출을 감소시켜 뉴런의 자발적인 탈분극에 대한 차단제 매개 억제를 확인합니다.

자발적인 꼬리 코일링 분석을 위해 배아를 0.2% DMSO가 함유된 생선 물로 채워진 90mm 원형 페트리 접시로 옮기고 날카로운 끝이나 바늘이 있는 두 개의 보석상 겸자를 사용하여 수동으로 변모막을 제거합니다. 그런 다음 배아를 섭씨 28도에서 5분 동안 배양합니다. 실체현미경에 장착된 디지털 카메라를 사용하여 1분 동안 비디오 녹화 중에 실온에서 꼬리 코일을 감지합니다.

다음으로, 초당 30프레임의 시간 해상도로 시계열을 획득합니다. 그런 다음 시간 단위당 굴곡 횟수를 계산하여 자발적인 테일 코일링의 빈도를 계산합니다. 약물 riluzole의 효과를 평가하기 위해 배아를 5마이크로몰 riluzole이 함유된 생선 물로 채워진 새로운 90mm 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 1분짜리 비디오를 녹화하고 행동 분석을 수행하기 전에 섭씨 28도에서 5분 동안 배아를 배양합니다.

이제 섭씨 37도에서 35mm 유리 바닥 이미징 접시 안에 생선 물의 1% 저융점 아가로스에 20-24hpf 배아를 장착합니다. 배아를 옆으로 향하게 하고 아가로스가 실온에서 응고될 때까지 기다립니다.

다음으로, 이미징 접시를 공초점 현미경의 스테이지로 옮깁니다. 488나노미터 아르곤 레이저로 단량체 Umikinoko-Green을 여기시켜 바이오센서를 발현하는 운동 뉴런을 식별합니다. 그런 다음 방출을 495나노미터에서 525나노미터 사이로 설정하고