생쥐의 후각 감각 뉴런에 대한 천공된 패치 클램프 기록

유전자 조작 쥐의 잘린 머리를 예로 들어 보겠습니다. 코의 후각 상피에는 형광단 태그가 지정된 냄새 수용체가 있는 후각 감각 뉴런(OSN)이 포함되어 있습니다.

피부를 제거하고 머리를 해부하여 후각 상피가 부착된 중격을 분리합니다.

기록실에서 상피를 분리하고 고정합니다.

형광 현미경을 사용하여 표지된 수용체를 검출하여 OSN의 수지상 손잡이를 표적으로 삼습니다.

막 천공 항생제인 니스타틴이 함유된 세포내 용액과 함께 기록 피펫을 가져옵니다.

피펫이 막히지 않도록 양압을 가하십시오. 피펫을 상피에 삽입하고 OSN에 접근합니다.

음압으로 전환하여 세포막과 밀봉을 형성합니다. 전류를 가하여 멤브레인을 휴지 전위로 유지합니다.

나이스타틴은 막을 천공하여 세포 내 이온 전류를 측정할 수 있습니다.

냄새 자극제가 들어 있는 피펫을 OSN 근처에 놓습니다. 냄새 수용체에 결합하는 각성제를 방출하여 이온 채널 개방을 촉발하여 이온 유입을 허용합니다. 결과 전기생리학적 신호를 기록합니다.

이 프로토콜의 경우 생후 2주에서 4주 사이에 마우스를 사용할 수 있습니다. 이 프레젠테이션에서는 OR/IRES/tauGFP를 발현하는 마우스를 사용합니다.

OR/IRES/tauGFP 마우스를 사용하여 관심 있는 OR을 발현하는 모든 뉴런은 GFP로 표지됩니다. 이 방법은 모든 영역에서 표현된 OR에 사용할 수 있습니다. 그러나 해부 및 기록은 등쪽 영역에서 발현된 OR에 대해 더 쉬울 것입니다.

마우스를 마취한 다음 목을 베는 것으로 시작합니다.

이 프로토콜의 결과는 해부의 품질에 따라 다릅니다. 이러한 해부 단계는 가능한 한 짧고 정확해야 합니다.

수술을 시작하려면 해부 가위를 사용하여 등쪽을 따라 세로로 절단합니다. 피부를 떼어내어 제거합니다. 그런 다음 아래턱을 따라 자르고 치아와 평행하게 관상 절단을 합니다. 따라서 윗 앞니를 제거하십시오. 이제 머리 주위, 눈 뒤에 관상 절단을 합니다. 뒤쪽 머리를 버리고 앞쪽 부분을 얼음처럼 차가운 링거병으로 옮깁니다.

이제 해부 현미경으로 5-10분 이내에 중격을 분리합니다. 복부를 따라 세로 절단으로 시작하십시오. 그런 다음 비강의 등쪽 측면을 따라 등쪽 뼈를 세로로 자릅니다.

다음으로 대부분의 뼈와 입천장을 제거합니다. 분리된 중격과 부착된 상피를 실온에서 산소가 함유된 링거병 용기에 옮깁니다. 5분 이내에 녹음 전 최종 준비를 하십시오.

용액이 너무 따뜻하지 않으면 제제가 손상된 것처럼 보