Whole-Cell Patch Clamp를 사용하여 Kisspeptin Neurons에 대한 테스트 성장 호르몬 효과 결정

aCSF가 관류된 기록 챔버에 형질전환 마우스 시상하부 절편을 고정합니다.

슬라이스에는 생식 기관 조절에 중요한 형광 융합 단백질 발현 키스펩틴 뉴런이 포함되어 있습니다.

내부 용액에 기록 전극을 포함하는 마이크로피펫을 조립합니다.

형광 키스펩틴 뉴런을 현미경으로 찾습니다.

피펫에 양압을 가하고 표적 뉴런을 향해 전진시킵니다. 접촉 시 압력은 신경막에 움푹 들어간 곳을 만듭니다.

짧은 음압을 가하여 마이크로피펫과 멤브레인 사이에 고저항 밀봉을 형성합니다.

정확한 측정을 위해 뉴런의 생리적 휴식 전위에서 유지 전압을 설정합니다.

짧은 음압 펄스를 가하여 멤브레인을 파괴하고 전체 셀 구성을 설정합니다.

매개변수를 모니터링하여 뉴런의 생존력을 확인합니다.

테스트 성장 호르몬을 도입하여 신호 전달 경로를 유발하고 뉴런의 막 전위의 변화를 유도합니다.

신경 활동에 대한 성장 호르몬의 억제 효과를 결정하기 위해 막 전위의 변화를 측정합니다.

아크릴 전사 피펫을 사용하여 관심 있는 뇌 절편을 한 번에 하나씩 기록 챔버로 옮깁니다. aCSF 관류 중에 움직이지 않도록 슬라이스 앵커로 슬라이스를 잡습니다. 침지 현미경의 저배율 대물 렌즈 10x 또는 20x를 사용하여 슬라이스를 기록 챔버의 중앙에 배치합니다.

슬라이스 위치는 현미경 아래에서 원하는 영역을 잘 볼 수 있고 기록 마이크로피펫에 완벽하게 도달할 수 있도록 하는 데 중요합니다. 관심 영역을 찾은 후 대물 렌즈를 고배율 렌즈인 63x로 전환하고 조직 수준에 초점을 맞추고 내인성 형광 단백질과 표적 영역의 세포 모양을 관찰하여 뇌 절편 표면의 키스펩틴 세포를 찾습니다.

가능한 대상 셀을 찾으면 마우스 커서를 사용하거나 관심 영역 위에 사각형과 같은 형식을 그려 컴퓨터 화면에 표시합니다. 표시된 컴퓨터 화면은 기록 마이크로피펫의 위치를 세포로 안내하는 데 도움이 됩니다. 표적 세포의 정확한 위치를 결정한 후 대물렌즈를 들어 올리고 내부 용액으로 채워진 기록 마이크로피펫을 전극 홀더에 삽입하여 내부 용액이 은 전극과 접촉하도록 합니다.

편이 마이크로피펫에 들어가는 것을 방지하기 위해 폴리에틸렌 튜브를 통해 마이크로피펫 홀더에 연결된 1-3밀리리터 공기 충전 주사기를 사용하여 마이크로피펫을 aCSF 용액에 담그기 전에 양압을 가합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로피펫을 대물렌즈 중앙 아래로 안내합니다. 마이크로 매니퓰레이터 버튼을 움직여 마이크로피펫의 x, y, z축을 관심 세포 쪽으로 안내합니다.

마이크로피펫의 팁이 보이도록 초점을 조정하고 초점을 더 가깝게 가져오되 슬라이스에 너무 가깝지 마십시오. 마이크로 매니퓰레이터의 속도를 줄이고 마이크로피펫을 초점면까지 천천히 내려 마이크로피펫 팁이 슬라이스를 갑자기 관통하지 않고 세포 표면이나 표적 영역에 닿을 때까지 천천히 하강하도록 합니다.

1-3밀리리터 공기로 채워진 주사기로 가벼운 양압을 가하여 접근 경로에서 이물질을 제거하고, x, y, z축에서 마이크로 매니퓰레이터를 천천히 움직여 마이크로피펫 팁을 더 가깝게 가져오고 표적 세포에 닿으면 가해진 압력에 의해 딤플이 발생합니다. 딤플을 설정한 후 소프트웨어의 전압 클램프 모드를 사용하여 마이크로피펫 홀더에 연결된 튜브를 통해 1-2초 동안 입으로 약한 짧은 흡입을 가하여 마이크로피펫과 세포 사이에 밀봉을 생성합니다.

씰이 약 1분 동안 소음 간섭 없이 기계적으로 안정적으로 유지되면 유지 전압을 관심 셀의 가장 가까운 생리학적 휴식 전위로 설정합니다. 키스펩틴 시상하부 뉴런의 경우 마이너스 50밀리볼트가 권장됩니다. 다음으로, 파열된 막이 마이크로피펫을 막거나 상당한 양의 막 부분 또는 세포를 끌어당기지 않도록 세포에 밀봉된 마이크로피펫 팁에서 원형질막을 입으로 짧게 흡입하여

충분한 힘으로 흡입을 수행함으로써 적절한 전체 셀 구성을 달성할 수 있습니다. 사용된 시스템 설정 매뉴얼을 확인하십시오. 세포막을 파괴한 후 전압 클램프 모드에서 전체 셀 옵션을 활성화하고 전체 셀 탭을 참조하는 자동 명령을 클릭합니다.

다음으로, 텍스트 원고에 설명된 대로 소프트웨어에서 세포 생존율 매개변수를 확인합니다. 실험 중에 시리즈의 저항과 셀의 정상 상태 정전 용량을 모니터링합니다. 전체 셀 구성이 제대로 달성되면 전압 클램프 모드에서 시냅스 전류를 측정합니다. 현재 클램프 모드에서 휴식막 전위의 변화와 유도된 휴식막 전위 변화를 기록합니다.