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신경과학
0 조회수 • 4:35 분 • July 8th, 2025
어두운 방의 기록 챔버 안에 어두운 적응 마우스 망막 조각을 가져 와십시오. 망막은 커버 슬립 위에 설정된 지지력 있는 인공 베이스 위에 놓여 있습니다. 슬라이스에 aCSF를 관류합니다.
망막 신경망에는 신경절 세포와 시냅스를 형성하는 양극성 세포에 시냅스로 연결된 광수용체가 포함됩니다.
레빈 근처에 기록 피펫을 놓습니다.
현미경으로 표적 신경절 세포에 접근하면서 양압을 가합니다.
음압으로 전환하여 막 패치를 당긴 다음 파열시켜 세포질과의 연속성을 확립합니다.
어둠 속에서 광수용체막은 탈분극된 상태로 유지되어 신경 전달 물질이 방출됩니다.
양극성 세포 수용체에 결합하는 신경 전달 물질은 양이온 채널 폐쇄를 유발하여 신호 전달을 억제합니다.
광수용체를 과분극시키기 위해 광펄스를 적용합니다. 신경 전달 물질 방출 감소는 양극성 세포에서 양이온 채널 개방을 촉발합니다.
양이온 유입은 신경절 세포 수용체에 결합하는 신경 전달 물질 방출을 유도하여 피펫에 의해 기록된 흥분성 시냅스 후 전위를 생성합니다.
패치 클램프 기록의 경우 관류 튜브를 Ames' 배지로 프라이밍하고 모든 기포가 튜브에서 통과하도록 합니다. 유리 풀러로 기록 피펫을 만든 후 팁에 피펫 용액을 다시 채웁니다. 다음으로 마이크로피펫 필러를 사용하여 피펫의 약 1/3을 채웁니다. 채워지면 각 피펫을 젖은 피펫 상자에 보관하십시오.
그런 다음 컴퓨터, 증폭기, CCD 카메라 및 현미경을 포함한 패치 클램프 기록 장비를 켭니다. 어두운 조건에서 작업할 때 적외선 뷰어를 사용하여 망막 슬라이스 준비를 현미경 스테이지에 배치합니다. 고정된 후 지속적인 관류를 시작합니다.
관류 온도를 섭씨 33도에서 37도로 설정합니다. CCD 카메라로 슬라이스 표면을 봅니다. 표적 세포 유형이 상주하는 표적 위치에 초점을 맞춥니다. 패치 클램프 기록을 위해 건강해 보이는 세포를 선택하십시오. 건강한 세포가 확인되면 기록 피펫을 피펫 홀더에 넣고 피펫을 슬라이스 준비로 전진시킵니다.
슬라이스 준비에 가까워지면 현미경으로 피펫 끝을 찾으십시오. 현미경으로 피펫 팁이 보이면 팁을 표적 세포 쪽으로 아래로 움직입니다. 그런 다음 증폭기를 설정하고 피펫을 나노암페어당 피코암페어 5볼트로 조정합니다. 약 5밀리볼트 및 약 10헤르츠의 두 개의 연속 전기 펄스를 시작하고 피펫 저항을 확인합니다.
이상적인 저항은 대부분의 망막 뉴런에 대해 5에서 12메가옴 사이입니다. 준비가 되면 마우스피스 또는 주사기를 사용하여 피펫 끝이 표적 세포 표면에 닿을 때까지 내부 용액을 불어냅니다. 양압이 세포 표면에 작은 보조개를 만들면 팁을 약간 전진시키고 불어오는 것을 멈춥니다.
피펫 저항이 지속적으로 증가하는 경우 그대로 두고 1기가옴 이상에 도달할 때까지 저항을 모니터링합니다. 저항이 저절로 증가하지 않으면 기가씰이 될 때까지 부드럽게 음압을 가하십시오. 기가씰이 달성된 후 유지 전위를 음의 70밀리볼트로 변경하십시오.
그런 다음 간헐적으로 음압을 가하여 피펫 팁 내부의 멤브레인을 파열시킵니다. 전체 셀 구성이 이루어지면 피펫 저항은 500메가옴에서 1기가옴 사이가 될 수 있으며 용량성 전류를 관찰할 수 있습니다. 음의 80에서 40밀리볼트까지 I-V 관계를 기록합니다. 셀 유형에 따라 다양한 유형의 전압 개폐 채널이 활성화됩니다. 마지막으로 빛으로 인한 시냅스 전류 또는 전압을 기록합니다.