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신경과학
0 조회수 • 4:27 분 • July 8th, 2025
재조합 바이러스 벡터에 감염된 CA3 뉴런을 포함하는 마우스 해마 뇌 절편을 취합니다.
바이러스 게놈은 형광 리포터와 전압 개폐 칼슘 채널의 발현을 하향 조절하는 마이크로RNA로 태그된 빛 활성화 채널을 발현합니다.
어두운 조건에서 기록 챔버에 슬라이스를 놓습니다. 현미경을 사용하여 형광 CA3 뉴런을 식별합니다.
감염된 CA3 뉴런으로부터 입력을 받는 CA1 뉴런에 기록 전극을 패치합니다. 세포 내 이온 전류를 기록하기 위해 멤브레인을 파열합니다.
억제제를 적용하여 억제성 신경 전달 물질 수용체를 차단하고 흥분 신호만 허용합니다.
광 펄스를 사용하여 감염된 CA3 뉴런의 빛 활성화 채널을 자극하여 활동 전위를 생성합니다.
감염되지 않은 생쥐의 경우 활동 전위가 전압 개폐 칼슘 채널을 활성화하여 신경 전달 물질 방출을 유발하는 칼슘 이온 유입을 유발합니다. 신경 전달 물질은 CA1 뉴런에서 흥분성 시냅스 후 전류(EPSC)를 유발합니다.
감염된 마우스에서 전압 개폐 칼슘 채널의 microRNA 매개 감소는 EPSC 억제를 초래합니다.
이 프로토콜의 경우, Cetin 및 회사에서 이전에 발표한 프로토콜에 따라 15일 이상 전에 rAAV1/2를 뇌에 주입한 동물을 사용합니다. 뇌를 분리하고 진동극술과 가스가 주입된 얼음처럼 차가운 aCSF로 급성 뇌 절편을 만듭니다.
관심 영역의 슬라이스를 수집하고 광유전학적 프로브의 활성화를 피하기 위해 빛에 대한 노출을 최소화합니다. 동일한 aCSF에서 섭씨 37도에서 슬라이스를 30분 동안 회복시킵니다. 뇌 절편을 보관하기 위해 특별히 설계된 챔버를 사용하십시오. 그런 다음 슬라이스를 실온으로 되돌려 6-8시간 동안 건강한 상태를 유지합니다.
계속하려면 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고 분당 2밀리리터의 aCSF로 슈퍼 퓨즈합니다. 다음으로, 발현된 형광 리포터의 신호를 간략하게 확인하여 감염의 국소화와 강도를 확인합니다. 그런 다음 패치 전극에 세포내 용액을 채웁니다.
이제 적외선 조명 아래에서 감염된 뉴런으로부터 시냅스 입력을 받는 뉴런에서 단단히 밀봉된 전체 세포 구성을 얻습니다. 직렬 저항은 보상되지 않은 상태로 둘 수 있지만 일정하고 낮아야 합니다. 예를 들어, CA3 피라미드 뉴런이 감염된 경우 CA1 영역의 근위부에서 내측로에 있는 피라미드 뉴런을 패치합니다.
세포가 줄어들거나 부풀어 오르기 시작하거나, 패치가 어려워지거나, 패치가 불안정해지면 선택한 슬라이스가 기록
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