Neuron-Astrocyte 공동 배양에서 Neuronal Network의 전기생리학적 활동 기록

다중 전극 어레이 또는 MEA 플레이트로 시작합니다. 각 웰에는 중앙에 위치한 전극 배열이 포함되어 있습니다.

어레이는 세포 접착을 용이하게하기 위해 배양 기질로 코팅됩니다.

운동 뉴런과 성상세포의 현탁액을 어레이 위에 물방울로 추가합니다.

세포 부착을 허용하기 위해 배양한 다음 세포 생존력을 유지하는 소분자가 보충된 따뜻한 공동 배양 배지를 추가합니다.

배양하는 동안 성상세포는 신경 성숙과 시냅스 형성을 촉진하는 인자를 분비하여 신경 네트워크를 생성합니다.

MEA를 생리학적 조건에서 기록 장치에 넣어 신경 활동을 모니터링합니다.

뉴런은 축삭을 따라 이동하는 활동 전위라고 하는 전기 신호를 전달합니다.

시냅스에 도달하면 신호는 신경 전달 물질 방출을 유발하여 신호를 다음 뉴런으로 전파합니다.

각 웰 내의 전극은 시냅스로 연결된 뉴런에 의해 생성된 신호를 세포외로 기록합니다.

동기화된 리드미컬한 전기 신호의 감지는 신경 네트워크의 확립을 확인합니다.

도금 당일 또는 도금 전에 먼저 PLO를 물 또는 PBS로 희석하여 24웰 MEA 플레이트 코팅을 시작합니다. 그런 다음 각 웰에 15-20마이크로리터의 PLO를 첨가하여 웰 중앙에 물방울을 형성하고 전극 영역을 덮고 피펫 팁으로 전극이 손상되지 않도록 합니다.

구획의 주변 우물에 물을 추가하여 충분한 습도를 유지하고 PLO를 섭씨 37도에서 1-2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 플라스틱 마이크로피펫 팁을 사용하여 전극을 건드리지 않고 가능한 한 많은 PLO를 흡인합니다. 다음으로 250마이크로리터의 물로 우물을 세 번 씻습니다.

피펫 팁을 사용하여 가능한 한 많은 물을 제거하고 뚜껑을 제거한 상태에서 표면을 건조시킵니다. 다음으로, 15-20마이크로리터의 희석된 라미닌을 첨가하여 각 전극 어레이를 덮습니다. 습도 구획에 물을 넣고 뚜껑을 교체한 후 섭씨 37도에서 최소 2시간에서 밤새 배양합니다.

도금 당일 운동 뉴런과 성상세포 배양액을 PBS로 한 번 헹군 후 0.05% 트립신을 첨가하고 섭씨 37도에서 약 5분 동안 배양하여 세포를 들어 올립니다. 트립신 억제제가 들어 있는 15밀리리터 원뿔형 튜브에 세포를 수집하고 배지 또는 베이스로 플레이트를 세척하여 모든 세포가 수집되었는지 확인합니다.

원심분리를 통해 세포를 펠릿으로 떨어뜨린 다음 1,000마이크로리터 피펫을 사용하여 20마이크로몰의 ROCK 억제제를 포함하는 공동 배양 배지로 운동 뉴런과 성상세포를 재현탁시켜 1밀리리터의 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 혈구계를 사용하여 운동 뉴런과 성상세포를 세고 계산하는 동안 세포 현탁액을 뚜껑을 덮고 섭씨 4도의 스티로폼 랙에 넣습니다.

두 세포 현탁액 1밀리리터를 300배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원하는 부피를 계산하고 펠릿을 다시 현탁합니다. 필요한 부피의 뉴런과 성상세포 현탁액을 동일한 비율로 결합하고 완전히 결합되도록 두 번 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.

그런 다음 플레이트의 각 웰에서 라미닌을 제거하고 최종 결합 세포 현탁액 10마이크로리터를 각 웰로 옮겨 전극 어레이를 덮는 작은 물방울을 형성합니다. 섭씨 37도에서 20-30분 동안 교란되지 않은 세포 액적과 함께 플레이트를 배양하여 플레이트에 초기 부착물을 형성합니다.

그런 다음 각 웰의 벽에 ROCK 억제제를 함유한 250마이크로리터의 따뜻한 공동 배양 배지를 아래로 피펫팅하고 각 웰의 반대쪽 벽에 동일한 부피를 피펫팅하고 플레이트를 섭씨 37도에서 24 내지 36시간 동안 배양합니다. 다음날 플레이트에 파편이나 죽은 세포가 있는지 검사하고 필요한 경우 배지를 ROCK 억제제가 포함된 신선한 공동 배양 배지로 교환합니다.

그렇지 않으면 공동 배양 2일째부터 시작하여 ROCK 억제제가 없는 공동 배양 배지를 사용하여 일주일에 두 번 반배지 교환을 수행합니다. 기록을 수행하려면 온도를 섭씨 37도, 이산화탄소를 5%로 설정하여 공동 배양 1일 후 가능한 한 빨리 시작하십시오. 그런 다음 플레이트를 기록기로 옮기고 기록하기 전에 최소 5분 동안 평형을 유지합니다. 실험 설계에 따라 격일로 또는 매주 1분에서 15분에 걸쳐 기본 활동을 기록합니다.