Simultaneous Measurement of Intracellular calcium and Membrane Potential in a Mouse Cerebral Endothelium(쥐 대뇌 내피에서 세포 내 칼슘 및 막 전위)

마우스 후대뇌동맥의 부분을 취합니다.

효소 용액과 함께 배양하여 조직 기질을 분해하여 세포를 느슨하게 합니다.

용액을 완충액으로 교체한 다음 세그먼트를 기록 챔버로 옮깁니다.

결합 조직과 평활근 세포층을 기계적으로 해리시켜 밑에 있는 내피관을 분리합니다.

튜브를 고정하고 해리된 층을 제거한 다음 생리학적 완충액을 추가합니다.

연속 버퍼 흐름이 있는 기록 시스템 내에 챔버를 배치합니다.

내피 세포에 들어가는 형광 칼슘 지시약을 도입한 다음 기록 전극을 세포에 삽입합니다.

칼슘 이온 유입을 유발하고 소포체에서 칼슘 방출을 위한 다운스트림 신호 전달을 유도하는 약물을 투여합니다.

지시약은 칼슘에 결합하고 여기 시 형광을 방출합니다.

칼슘 증가는 칼슘 의존성 칼륨 채널을 활성화하여 칼륨 유출을 유발하고 막 전위를 변경합니다.

전극을 사용하여 형광 신호와 막 전위를 통해 세포내 칼슘의 변화를 동시에 기록합니다.

이 절차에서는 현미경, 카메라, 챔버와 미세 조작기를 고정하는 알루미늄 스테이지를 사용하여 분쇄 장치를 준비합니다. 스테이지와 시편에 인접한 펌프 컨트롤러로 마이크로 주사기를 고정합니다. 그런 다음 분쇄 피펫에 미네랄 오일을 완전히 채우고 마이크로 시린지 피스톤 위에 고정합니다.

그런 다음 펌프 컨트롤러가 있는 마이크로 주사기를 사용하여 기포가 없는지 확인하면서 약 130나노리터의 해리 용액을 피펫으로 빼냅니다. 그 후, 온전한 동맥 분절을 10밀리리터 유리관에 필요한 농도의 효소가 포함된 해리 용액 1밀리리터에 넣습니다.

부분 소화를 위해 섭씨 34도에서 10-12분 동안 배양합니다. 소화 후 효소 용액을 5밀리리터의 신선한 해리 용액으로 교체합니다. 1밀리리터 피펫을 사용하여 실온에서 한 세그먼트를 해리 용액이 들어 있는 챔버로 옮깁니다.

그런 다음 피펫을 챔버의 해리 용액에 넣고 소화된 용기의 한쪽 끝 가까이에 놓습니다. 부드러운 분쇄를 위해 펌프 컨트롤러에서 초당 2-5나노리터 범위의 속도를 설정합니다. 100배에서 200배의 배율로 보면서 동맥 분절을 빼내고 배출하여 내피관을 생성하면서 평활근 세포를 해리시킵니다.

필요한 경우 끝이 가는 집게를 조심스럽게 사용하여 해리된 외막과 내부 탄성층을 내피관에서 분리합니다. 모든 평활근 세포가 해리되고 내피 세포만 온전한 관으로 남아 있는지 확인합니다.

마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 붕규산 유리 피닝 피펫을 사용하여 초융합 챔버의 유리 커버슬립에 내피 튜브의 각 끝을 고정합니다. 챔버에서 해리된 외막 및 평활근 세포를 씻어내고 해리 용액을 2밀리몰 염화칼슘 PSS로 교체합니다.

내피 튜브에 고정된 모바일 플랫폼을 과융합 현미경 및 실험 장비로 옮깁니다. 그런 다음 실험 중에 PSS 및 해당 약물 용액의 연속 전달을 위해 6개의 깨끗한 50밀리리터 저장소를 사용합니다.

인라인 유량 제어 밸브를 사용하여 유량 공급을 진공 흡입에 맞추면서 유량을 층류와 일관되게 수동으로 설정합니다. 백그라운드 데이터 및 염료 로딩을 기록하기 전에 최소 5분 동안 내피관의 과융합을 위해 PSS를 챔버에 전달합니다.

세포내 칼슘 농도와 동시에 막 전위를 측정하려면 날카로운 전극을 당기고 2몰 염화칼륨으로 다시 채워 Fura-2 염료가 로드된 세포에서 기록합니다.

염료 전달을 통한 세포간 결합을 연구하려면 2몰 염화칼륨에 용해된 0.1% 요오드화프로피듐으로 미세전극을 다시 채웁니다. 다음으로, 마이크로 매니퓰레이터로 고정된 전위계 헤드 스테이지에 부착된 피펫 홀더의 염화물로 코팅된 은선 위에 전극을 놓습니다.

마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극의 끝을 챔버의 흐르는 PSS에 잠시 배치하면서 4배 대물렌즈를 통해 봅니다. 그런 다음 접지 수조 전위와 일치하도록 휴식 막 전위를 0으로 설정합니다.

원하는 경우 전위계에 연결된 가청 기준선 모니터를 사용하여 소리 피치를 잠재적인 녹음과 연결합니다. 그런 다음 40배 대물렌즈를 사용하여 배율을 400배로 높이고 전극 끝을 내피관의 세포 바로 위에 배치합니다.

약 50-80개의 내피 세포에 초점을 맞추기 위해 측광 소프트웨어를 사용하여 측광 창을 조정합니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극을 내피관의 세포 중 하나에 부드럽게 넣고 휴식막 전위가 안정화될 때까지 최소 2분 동안 기다립니다.

휴식막 전위가 예상 값에서 안정되면 빛이 없는 상태에서 형광 계면의 광전자 증배관을 켜고 510나노미터에서 형광 방출을 수집하면서 340 및 380 나노미터에서 Fura-2를 번갈아 여기시켜 세포내 칼슘 농도 획득을 시작합니다.

막 전위와 세포내 칼슘 농도의 동시 측정이 확립되면 약물을 적용하기 전에 일정한 층류 유속에서 내피관과 PSS의 초융합을 위해 약 5분 동안 허용합니다.

PSS에서 준비된 약물을 일정한 유속으로 초융합 챔버에 도포합니다. 약물 치료 중 F340/F380 비율의 막 전위를 동시에 측정합니다. 실험이 완료되면 전극을 셀에서 빼냅니다. 그런 다음 막 전위 및 세포내 칼슘 농도의 각 기록을 중지하고 데이터 분석을 위해 파일을 저장합니다.