Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상
September 1st, 2011
생체내에 이미징 프로토콜 등의 루트 호감 다음과 같은 기본 감각 axons를 모니터가 설명되어 있습니다. 절차는 넓은 필드 형광 현미경 및 thy1 - YFP 유전자 변형 생쥐를 활용하고, CNS의 인터페이스와 PNS와 축삭의 상호 작용에서 4cm 이상의 축삭 재생의 반복 영상을 허용합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 척추 뿌리 손상 후 상당한 재생을 유도하는 방법을 발견하기 위해 등쪽 뿌리 재생을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 오른쪽 L 5개의 등쪽 뿌리를 노출하고 척수와 등쪽 뿌리에서 YFP 표지 양성 축삭을 시각화할 수 있는 척추 반구 절제술을 만들어 수행됩니다. 다음으로, L 5개의 등쪽 뿌리를 조심스럽게 으깨어 출혈을 최소화합니다.
그런 다음 파쇄 후 파쇄 부위를 이미지화하여 병변에서 손상된 등뿌리의 위치를 확인합니다. 여러 시점에 걸쳐 손상 부위와 등쪽 뿌리 진입 영역을 이미지화하여 손상된 축삭돌기가 척수로 재생되는 능력을 확인합니다. 궁극적으로, 재생 중인 축삭돌기가 빠르게 움직이지 못하고 등뿌리 진입 영역 또는 DREZ에 들어갈 때 정지 상태를 유지한다는 결과를 얻을 수 있습니다.
죽은 동물의 이미징과 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 몇 주 또는 몇 달에 걸쳐 살아있는 동물에서 이 시스템을 반복적으로 이미지화할 수 있다는 것입니다. 먼저 온도 조절 장치로 제어되는 가열 패드를 형광 실체 현미경 아래에 놓고 가열 패드에서 출력을 섭씨 32.5도로 조정하고 척수 세척을 위해 섭씨 32.5도로 예열 멸균 링거 용액을 섭씨 32.5도로 조정합니다. 수술 중에는 자일라진과 케타민 칵테일의 복강 내 주사로 동물을 마취합니다. 진통제인 부프레노르핀의 초기 용량도 피하로 투여합니다.
적절한 수준의 마취는 만져질 수 있는 반사가 없고 동물이 발가락 꼬집음에 반응하지 않을 때 이루어집니다. 마취가 확인되면 작은 동물 이발기로 등 위쪽을 면도하고 면도 부위에 면봉으로 제모 로션 한 방울을 떨어뜨립니다. 몇 분 후, 바른 로션과 남은 털을 비눗물로 제거합니다.
마지막으로 70% 에탄올에 적신 거즈 스폰지를 사용하여 수술 부위를 완전히 청소합니다. 동물을 가열 패드에 놓고 70% 에탄올에 적신 면봉으로 피부를 소독합니다. 멸균 수술용 드레이프는 시연 목적으로 적용해야 합니다.
이 비디오에는 표시되지 않습니다. 실체 현미경의 명시야 조명 아래에서 등 피부를 2-3cm 정중선으로 절개합니다. 필요한 경우 면봉을 사용하여 출혈을 멈춥니다.
미세한 집게와 뼈 턱으로 척추 근육 조직을 반사합니다. 밑에 있는 요추를 노출시킵니다. 작은 r 배심원을 사용하여 오른쪽 편미 후판 절제술로 L 3을 S 1 척추 분절에 노출시킨 다음 따뜻한 멸균 링거 용액으로 구멍을 관류합니다.
롤링된 면 거즈로 만든 지지 쿠션 위에 동물을 놓습니다. 척추를 평평하게 합니다. 수축 고리를 사용하여 노출 영역을 넓히십시오.
이 시점에서, 첫 번째 마취제 주입 후 약 30분 후, 동물을 완전히 마취 상태로 유지하기 위해 보충제를 주입해야 합니다. 형광 여기(fluorescent excitation)로 전환하여 FP가 축삭돌기를 표지한 이유를 시각화합니다. 27 및 반 게이지 바늘 끝을 사용하여 L 5 등쪽 뿌리 관류 위에 있는 경막을 링거 용액으로 반복해서 절개하고 면봉으로 부드럽게 청소합니다.
부서질 현장을 식별하고 손상되지 않은 노출된 전체 영역의 이미지를 캡처합니다. 이는 후속 이미징 세션에서 부상 부위를 식별하는 데 도움이 됩니다. 그런 다음 한 쌍의 미세한 집게의 한쪽 면을 삽입합니다.
집게를 부드럽지만 단단히 닫고 L 5 뿌리의 내측 부분을 10초 동안 잡고 집게를 부드럽게 놓는다. 생리학적 용액으로 반복해서 씻고 면봉으로 부드럽게 청소하십시오. 저배율과 고배율 모두에서 크러쉬 전과 직후의 크러쉬 부위와 DREZ를 포함하여 노출된 전체 영역의 여러 이미지를 얻습니다.
촘촘하게 이미징한 후, 얇은 합성 매트릭스 멤브레인 조각을 바르고 노출된 척수 위에 인공 경막을 적용하여 노출된 척수 창에 정확하게 맞도록 합니다. 멸균 5개 봉합사로 근육 조직을 봉합하고 상처 클립으로 정중선 절개 부위를 봉합합니다. 링거 용액을 피하로 주입하고 이틀 동안 12시간마다 근육 주사를 통해 수술 후 진통제로 부프레노르핀을 투여합니다.
앞서 설명한 대로 자일라진과 케타민으로 동물을 마취하고 상처 클립과 봉합사를 제거합니다. 인공 경막과 얇은 합성 매트릭스 멤브레인 패치를 제거하고 나중에 재사용할 수 있도록 링거 용액이 들어 있는 멸균 튜브에 보관하십시오. 다음으로, 26게이지 바늘의 구부러진 끝과 따뜻한 링거 용액으로 자주 관류하는 가는 집게로 쌓인 결합 흉터 조직을 부드럽게 제거합니다.
분쇄 부위 및 등쪽 뿌리 진입 영역을 포함한 수술 영역을 다시 노출시키고 재생에 대한 지속적인 이미징을 위해 이전 세션에서 이미지화된 YFP 표지 축삭을 재배치합니다. 여기에서 컬러 화살표로 표시된 4개의 표면 YFP 표지 축삭이 크러시 직후에 표시됩니다. 크러시 3일 후, 4개의 축삭돌기는 모두 크러시 후 2일 동안 강조된 바와 같이 크러시 부위를 통해 자라는 단일 신경돌기를 확장합니다.
신경돌림은 안정적으로 유지되며 이러한 축삭돌기 또는 다른 근위 축삭돌기에서 추가 성장이 없습니다. 4일째에 재생 신경돌기는 아끼지 않은 축삭돌기보다 얇고 희미합니다. 2주 동안 2일 또는 3일에 한 번씩 이 축삭돌기의 끝부분을 반복적으로 촬영한 결과, 축삭돌기가 앞으로 자라거나 수축하지 않고 일부 축삭돌기의 끝부분과 축이 부풀어 오르면서 움직이지 않았음을 알 수 있습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 축삭 재생을 금지하거나 촉진하는 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 L five do root를 노출, 분쇄 및 관찰하는 방법을 잘 이해해야 합니다.
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개요
본 논문은 척수 후근 손상 후 주요 감각 신경 축삭을 모니터링하기 위한 생체 내 영상 프로토콜을 제시합니다. 광범위 현미경과 thy1-YFP 형질전환 마우스를 활용하여, 본 방법은 PNS 내 4cm에 걸친 축삭 재생 및 CNS 인터페이스와의 상호 작용을 반복적으로 영상화할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 재생
- 영상 기술
배경
- 척수 후근 재생에 대한 이해는 척수 손상 치료법 개발에 매우 중요합니다.
- 본 연구는 시각화를 위해 YFP로 표지된 양성 신경 축삭을 사용합니다.
- 이전 연구에서는 척수 손상 후 신경 축삭 재생의 어려움이 입증되었습니다.
- 영상 기술은 재생 과정을 모니터링하는 데 필수적입니다.
연구 목적
- 척수 후근 재생 메커니즘을 조사합니다.
- 손상 후 상당한 신경 축삭 재생을 유도하는 방법을 탐색합니다.
- 재생 중인 신경 축삭의 행동을 실시간으로 시각화합니다.
사용된 방법
- 척수 반 감람절 절제술을 통해 오른쪽 L five 척수 후근을 노출합니다.
- L five 척수 후근의 출혈을 최소화하면서 주의 깊게 압착합니다.
- 손상된 신경의 위치를 확인하기 위해 손상 부위를 영상화합니다.
- 척수 내 신경 축삭 재생을 평가하기 위해 시간 경과에 따른 반복적인 영상화합니다.
주요 결과
- 재생 중인 신경 축삭은 척수 후근 진입 부위에서 빠르게 고정되는 것이 관찰되었습니다.
- 영상은 손상 후 신경 행동의 역학을 보여줍니다.
- 결과는 CNS 진입 시 신경 이동의 어려움을 시사합니다.
- 데이터는 재생 메커니즘에 대한 추가 연구의 필요성을 뒷받침합니다.
결론
- 본 프로토콜은 생체 내 신경 축삭 재생을 효과적으로 모니터링합니다.
- 연구 결과는 척수 손상 회복에 대한 이해에 기여합니다.
- 향후 연구에서는 신경 축삭 재생 기술 개선에 중점을 둘 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Monitoring dorsal root axon regeneration in vivo provides critical insights into the biological barriers at the dorsal root entry zone, a key challenge in developing therapies for spinal root injuries. Real-time imaging enables mechanistic de-risking of regeneration hypotheses by capturing dynamic axon behavior over time, supporting target validation in preclinical models. This approach enhances predictive confidence in identifying molecular interventions that could promote CNS-PNS axon integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing axon immobilization at the DREZ, clarifying regeneration failure mechanisms.
- Operational Value: Supports biological de-risking through repeated longitudinal imaging of individual axons in living animals, reducing reliance on endpoint analyses.
- Predictive Value: Generates quantitative data on axon tip stability and growth arrest, informing target selection for pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a reproducible imaging platform using thy1-YFP mice and wide-field microscopy to monitor axon dynamics across multiple time points.
- Quantitative Output: Enables measurement of neurite extension, tip swelling, and immobilization, providing standardized readouts for compound screening.
- Scalability: Facilitates simultaneous tracking of multiple labeled axons per animal, increasing throughput for regeneration studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models sensory axon regeneration failure in spinal root injury, aligning with preclinical evaluation of neurorestorative therapies.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by capturing regeneration dynamics relevant to human DREZ biology.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic evidence to prioritize targets that overcome axonal immobilization at the CNS-PNS interface.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, offering dynamic validation of axon regeneration phenotypes before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing real-time axon behavior at the DREZ, clarifying whether growth inhibition or guidance failure dominates regeneration failure.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible imaging of axon regeneration with quantifiable metrics such as neurite length and tip morphology over time.
- Analytics: Enables statistical comparison of regeneration conditions through repeated imaging sessions, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling the human DREZ barrier, informing biomarker strategies for axon growth competence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging workflow for longitudinal neuroregeneration studies across multiple injury models and therapeutic candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around axon regeneration failure at the DREZ.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through repeatable surgical and imaging procedures in living animals.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct visualization of axon regeneration outcomes, reducing late-stage biological risk in neuroregeneration programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates based on demonstrated ability to promote axon growth past the DREZ barrier.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, anesthesia management, and in vivo wide-field fluorescence imaging.
- Dependent on access to thy1-YFP transgenic mouse lines and temperature-controlled imaging platforms to maintain physiological conditions.
- Necessitates standardized postoperative care and imaging intervals to minimize variability across longitudinal sessions.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different spinal regions or injury models beyond L5 dorsal root crush.
- Limited by the superficial positioning of labeled axons, which may restrict applicability to deeper CNS tracts without methodological modification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Preparation for Surgery
2:19
Laminectomy and Surgical Exposure of the L5 Dorsal Root
3:21
Rhizotomy/Dorsal Root Crush
4:10
Image Acquisition and Post-op Procedures
4:51
Repeated Imaging
5:32
Axonal Regeneration Following Dorsal Root Crush
6:16
Conclusion
