Drosophila의 감각 뉴런에서 생리적 반응 감지

마취된 유전자 변형 초파리 멜라노가스터를 커버슬립에 옆으로 부착합니다.

앞다리를 펴고 고정하여 족근 부분을 노출시킵니다.

이 세그먼트에는 칼슘 결합 형태로 형광을 발현하는 칼슘 지표 복합체를 발현하는 미각 뉴런이 있습니다.

용액을 유지하기 위해 플라이 주위에 소수성 장벽을 그립니다.

파리가 회복되도록 하고 노출된 눈꺼풀 부분에 완충된 식염수를 겹

공초점 현미경으로 눈꺼풀 세그먼트를 관찰하고 다양한 깊이에서 미각 뉴런을 이미지화하여 자극 전 형광을 얻습니다.

유성 리간드를 포함하는 자극 용액을 세그먼트에 추가합니다.

이 리간드는 미각 뉴런 수용체에 결합하여 신호 전달 경로를 시작하고 칼슘 채널의 개방을 유발합니다.

이를 통해 세포외액의 칼슘 이온이 세포질로 들어가 칼슘 지시제 복합체에 결합하여 형광 방출이 발생합니다.

다시 관찰하면 신경 형광의 증가는 리간드에 대한 신경 생리학적 반응을 확인합니다.

파리를 마취한 후 투명한 매니큐어를 아주 작은 방울로 사용하여 0.17mm 커버슬립에 부착합니다. 전체 드롭을 사용하여 플라이의 측면을 슬라이드에 부착합니다. 다음으로, 해부 현미경으로 젖은 붓을 사용하여 파리의 앞다리를 뻗습니다. 그런 다음 두 개의 매우 얇은 테이프 스트립을 사용하여 첫 번째와 다섯 번째 족근 부분을 커버슬립에 고정합니다.

코의 뉴런을 이미지화하려면 코의 위에 또 다른 얇은 테이프 스트립을 놓아 망피를 노출시킵니다. 이제 PAP 펜을 사용하여 플라이 주위에 짧은 벽을 만드십시오. 측정하기 전에 30분 동안 마취를 풀도록 하십시오. 이 프로토콜의 경우, PBST를 사용하여 밀리리터당 1밀리그램 스톡 리간드 용액의 필요한 희석액을 준비합니다.

절차를 시작하려면 고정되고 노출된 눈꺼풀 부분에 10마이크로리터의 PBST를 오버레이합니다. 이렇게 하면 다리가 촉촉해지고 초점이 흐려지는 것을 방지할 수 있습니다. 다음으로, sCMOS 카메라가 장착된 회전 디스크 공초점 현미경과 같이 빠른 시간 분해능으로 우수한 형광 신호를 얻을 수 있는 광학 시스템을 사용하여 세그먼트에 초점을 맞춥니다. 족근 분절에서 관심 있는 뉴런의 3개의 사전 자극 Z-스택을 수집합니다.

이 예에서 이미지는 200밀리초 노출과 2초마다 6미크론 x 1/2미크론 섹션에 대한 2x2 비닝으로 캡처됩니다. 레이저의 출력을 최적화하여 광표백을 최소화하면서 높은 신호 대 잡음비를 허용해야 합니다. 여기에서는 491나노미터, 100밀리와트 레이저가 30% 투과율로 작동합니다.

신호는 자극 전에 감지할 수 있어야 하지만 포화 상태에 접근해서는 안 됩니다. 이제 10마이크로리터의 자극 용액을 관심 있는 눈근 부분에 피펫팅합니다. 피펫팅하는 동안 다리나 파리의 몸에 닿지 않도록 각별히 주의하십시오. 그런 다음 즉시 첫 번째 자극 후 이미지를 획득하고 형광의 최대 변화를 문서화할 수 있는 충분한 이미지를 계속 수집합니다.