Mouse Cochlea의 특정 주파수 영역에서의 리본 시냅스 평가

비특이적 상호 작용을 방지하는 투과제와 차단제로 사전 처리된 마우스 달팽이관 회전이 포함된 튜브로 시작합니다.

각 회전은 서로 다른 소리 주파수를 감지하고 소리를 전기 신호로 변환하는 유모 세포를 포함합니다. 이러한 신호는 리본 시냅스의 신경 전달 물질을 통해 청각 신경으로 전달됩니다.

용액을 제거하고 리본 시냅스에서 모발 및 신경 세포의 단백질과 상호 작용하는 1차 항체를 첨가한 다음 세척합니다.

1차 항체에 결합하는 빨간색 및 녹색 형광단으로 태그가 지정된 2차 항체와 함께 배양합니다.

결합되지 않은 2차 항체를 제거하기 위해 세척합니다.

핵 염료가 포함된 마운팅 매체가 있는 유리 슬라이드에 표본을 놓아 핵을 파란색으로 염색합니다.

커버슬립을 장착합니다. 건조시킨 다음 공초점 현미경을 사용하여 다양한 깊이에서 각 세그먼트를 이미지화합니다.

리본 시냅스는 빨간색과 녹색 점점이 가깝게 배치된 것으로 나타납니다.

각 턴마다 이러한 기능적 누점을 세어 소리 주파수에 대한 반응의 상관 관계를 파악합니다.

해부 후 각 달팽이관을 개별 2.5밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 로테이터에서 실온에서 1시간 동안 0.1% Triton X-100의 PBS에 있는 10% 염소 혈청으로 비특이적 결합을 차단합니다.

배양이 끝나면 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 해부 현미경으로 용액을 제거합니다. PBS의 5% 염소 혈청 및 0.1% Triton X-100에 희석된 관심 1차 항체와 함께 회전 장치에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

다음날 아침, 조직 샘플을 세척당 차가운 0.1몰 PBS로 5분 동안 세 번 헹구어 잔류 1차 항체를 제거합니다. 그런 다음 PBS의 5% 염소 혈청과 0.1% Triton X-100에 희석된 적절한 2차 항체로 검체를 현상에서 2-3시간 동안 빛으로부터 보호합니다.

배양이 끝나면 시연된 대로 0.1몰 PBS로 샘플을 세 번 세척하고 시편을 0.1몰 PBS가 포함된 개별 35mm 플레이트로 옮깁니다. DAPI가 보충된 마운팅 매체 한 방울을 슬라이드에 놓고 PBS에서 마운팅 매체로 표본을 옮깁니다. 커버슬립의 한쪽 가장자리를 각 슬라이드에 놓고 놓아 커버슬립이 부드럽게 떨어지도록 합니다. 그런 다음 슬라이드 상자에서 슬라이드를 섭씨 4도에서 밤새 건조시킵니다.

표본을 이미지화하려면 적절한 레이저와 63x 고해상도 오일 침지 렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하십시오. 각 달팽이관 회전에서 8마이크로미터 공초점 z-스택을 획득합니다. 시냅스 누점 수의 경우, 내부 유모 세포의 전체 길이에 걸쳐 0.3마이크로미터 스텝 크기로 z-스택을 설정하여 모든 시냅스 누점을 이미지화할 수 있도록 하고, 누점 포함 이미지를 스택에 병합하여 z축 투영을 얻습니다.

병합된 이미지를 적절한 이미지 처리 소프트웨어 프로그램으로 가져옵니다. 특정 주파수 영역에서 각 z-스택의 시냅스 총 수를 DAPI 양성 내부 유모 세포의 수로 나누어 각 세포의 시냅스 점점 수를 계산합니다. 각각의 특정 주파수 영역에서 9-11개의 내부 유모 세포를 포함하는 서로 다른 미세한 필드의 3개 이미지에서 모든 시냅스 점점을 평균화합니다.

세포골격 구조와 시냅스 국소화를 더 잘 시각화하려면 브러시 도구를 사용하여 개별 내부 유모 세포의 시냅스 구조와 분포를 시각적으로 평가합니다. 시냅스 전 리본과 시냅스 후 수용체 패치의 병치를 검사하려면 직사각형 선택 윤곽 도구를 사용하여 리본 주변의 복셀 공간을 추출하고 이미지 절단을 사용하여 개별 리본을 분리합니다. 그런 다음 이미지 및 이미지 크기를 클릭하여 쌍을 이루는 시냅스와 고아 리본을 식별하는 데 사용할 수 있는 이러한 미니어처 투영의 썸네일 배열을 획득합니다.