Isolation of Cell-Surface and Intracellular Proteins from an Astrocyte Culture

성상세포 배양액을 취하고 배지를 제거합니다. 생리학적 완충액을 첨가하고 얼음 위에서 배양하여 세포 표면 단백질의 엔도사이토시스를 억제합니다.

세포 표면 단백질에 결합하는 비오티닐화 시약과 함께 배양합니다.

다음으로, 담금질 완충액과 함께 배양하여 반응되지 않은 시약을 비활성화합니다.

차가운 생리학적 완충액을 추가하고 세포를 기계적으로 분리합니다. 세포를 옮긴 다음 원심분리하여 상청액을 버립니다.

용해 완충액과 함께 배양하여 세포를 용해하여 비오티닐화된 세포 표면 및 비오티닐화된 세포내 단백질을 방출합니다.

원심분리하여 상청액을 수집하고 총 단백질 함량이 있는 분획을 분리합니다.

비오티닐화된 단백질에 결합하는 스트렙타비딘 코팅 비드와 함께 교반 하에 나머지 분획을 배양합니다.

세포 표면 단백질 결합 비드를 회전시키고 세포내 단백질을 포함하는 상청액을 분리합니다.

반 하에 비드를 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 제거한 다음 원심분리하여 상청액을 버리고 세포 표면 단백질을 분리합니다.

총, 세포내 및 세포 표면 단백질을 포함하는 분획은 분석할 준비가 되었습니다.

이 절차를 시작하려면 인큐베이터에서 성상세포 배양물을 제거하고 흡인으로 배지를 폐기합니다. 식힌 CM-PBS 4밀리리터로 세포를 세 번 씻고 으깬 얼음 위에 접시를 놓습니다.

흡인에 의해 CM-PBS를 제거한 다음 2밀리리터의 비오틴 완충액을 각 웰에 피펫팅합니다. 배양액을 얼음 위에 30분 동안 놓기 전에 접시를 앞뒤로 부드럽게 몇 번 기울여 완전히 덮을 수 있도록 합니다.

그런 다음 비오틴 완충액을 제거하고 담금질 완충액 4밀리리터로 교체한 다음 배양액을 얼음 위에 10분 동안 보관합니다. 다음으로, 배양액을 얼음 위에 10분 동안 두기 전에 흡인하고 같은 양의 담금질 완충액으로 교체합니다.

그런 다음 담금질 완충액을 버리고 냉각된 CM-PBS 4밀리리터로 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 세포를 냉각된 CM-PBS 1밀리리터로 긁어내고 현탁액을 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 섭씨 4도로 설정된 냉장 미세 원심분리기에서 3 분 동안 100g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 그 후, 상청액을 버리고 세포를 500마이크로리터의 용해 완충액에 재현탁합니다.

그런 다음 샘플을 얼음 위에 30분 동안 그대로 두고 5분마다 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 용해물을 섭씨 4도에서 10분 동안 14,000g 으로 원심분리하여 세제 및 수용성 물질을 펠릿화합니다. 그런 다음 상청액을 새 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 50마이크로리터의 용해물을 저장하고 25마이크로리터의 3x 로딩 완충액을 추가합니다.

그런 다음 건식 욕조에서 섭씨 95도에서 가열하여 변성시킵니다. 이것은 비오티닐화된 세포 표면 단백질과 비오티닐화된 세포질 단백질을 모두 포함하는 입력 분획입니다. 절단된 피펫 팁을 사용하여 75마이크로리터의 스트렙타비딘 아가로스 비드를 용해물로 옮기고 셰이커에서 섭씨 4도에서 3시간 동안 배양합니다.

그 후, 스트렙타비딘 아가로스 비드를 섭씨 4도에서 30초 동안 1,500g에서 원 심분리하여 펠릿화합니다. 상층액 50마이크로리터를 저장하고 3x 로딩 완충액 25마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 수조나 가열 블록에서 섭씨 95도에서 변성시킵니다. 이것은 세포내 분획을 나타내며 주로 비오티닐화되지 않은 세포질 단백질로 구성됩니다.

그런 다음 펠릿 비드를 1밀리리터의 세척 완충액에 재현탁하고 섭씨 4도에서 3분 동안 흔듭니다. 구슬을 펠릿화하고 상청액을 버립니다. 비오틴화된 세포질 단백질의 비특이적 결합을 최소화하기 위해 이 과정을 네 번 더 반복합니다.

용해 완충액을 사용하여 1배로 희석한 로딩 완충액 50마이크로리터를 추가합니다. 비드를 섭씨 95도에서 변성시켜 비드에서 비오틴과 스트렙타비딘을 방출합니다. 이 분획은 비오티닐화된 세포 표면 단백질만 포함해야 합니다.