해마 뉴런을 이용한 단백질의 매력 또는 반발성 활동 평가

JoVE Encyclopedia of Experiments

신경과학

0 조회수 • 3:45 분 • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

입구 및 출구 포트에 연결된 여러 개의 작은 채널이 있는 실리콘 매트릭스가 포함된 접시로 시작하십시오.

채널

을 채우기 위해 입구를 통해 반발 활성이 있는 테스트 단백질을 주입합니다.

채널 영역에서 단백질이 부착되도록 배양하여 테스트 단백질 영역을 형성한 다음 세척합니다.

매트릭스를 제거하고 코팅된 영역에 매력적인 활성을 갖는 대조군 단백질을 오버레이하고 배양합니다.

이렇게 하면 테스트 단백질 영역 사이의 빈 영역에 대조군 단백질이 부착되어 줄무늬 패턴이 번갈아 가며 대조군 단백질 영역을 생성한 다음 세척할

수 있습니다.

라미닌을 첨가하여 줄무늬 부위를 코팅한 다음 씻습니다.

해마 뉴런의 단일 세포 현탁액으로 코팅된 영역을 시드하고 배양합니다.

테스트 단백질 영역에서 뉴런은 단백질과 상호 작용하여 뉴런을 격퇴하여 부착을 억제하는 신호를 트리거합니다.

대조적으로, 제어 단백질 영역의 뉴런-단백질 상호 작용은 뉴런 부착을 촉진하여 성장과 축삭 확장을 지원합니다.

PBS에서 형광 표지된 재조합 단백질을 준비합니다. 각 줄무늬 접시에 대해 25마이크로리터를 만드십시오. 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 접시에 대해 22게이지 주사기에 25마이크로리터의 희석된 단백질을 넣고 매트릭스 측면의 작은 구멍을 통해 주입합니다.

기포를 매트릭스에 주입하면 단백질이 질병에 결합하는 것을 방해할 수 있으므로

피하십시오.

이제 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 30분 동안 접시를 배양합니다. 배양 후, 300마이크로리터의 PBS를 각 매트릭스의 상단 슬릿에 증착합니다. 그런 다음 각 매트릭스 측면에 있는 작은 구멍에서 PBS를 흡인하여 부착되지 않은 모든 재조합 단백질을 제거합니다. 단백질이 건조해지므로 PBS를 완전히 흡인하지 마십시오.

이 PBS 헹굼을 총 3회 수행합니다. 그런 다음 각 접시에서 매트릭스를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 줄무늬 영역 전체에 약 100마이크로리터의 대조군 단백질을 즉시 추가하여 각 접시에 대체 코팅을 만듭니다.

다음으로 접시를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 한편, 얼음 위에서 PBS의 라미닌을 밀리리터당 20마이크로그램으로 해동합니다. 30분 후 PBS로 접시를 세 번 씻습니다. 그런 다음 각 접시에 약 100마이크로리터의 차가운 라미닌을 바르고 접시를 인큐베이터에 다시 한 시간 더 넣습니다.

한 시간 후 PBS를 사용하여 다시 세 번 설거지를 합니다. 세 번째 세척 후 각 접시에 약 150마이크로리터의 배양 배지를 추가합니다. 그런 다음 다음에 필요할 때까지 섭씨 5도의 37% 이산화탄소 인큐베이터에서 접시를 배양합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산하고 준비된 각 스트라이프 플레이트에서 150마이크로리터의 배양 배지에서 10,000개의 뉴런을 재생합니다. 전체 줄무늬 영역을 덮도록 현탁액을 조심스럽게 넣으십시오.

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마지막 업데이트: 1 8월 2026