뇌 조직 추출물에서 아밀로이드 섬유의 분리

비아밀로이드 단백질과 불용성 단백질 응집체인 아밀로이드 원섬유를 함유한 마우스 뇌 조직 추출물을 섭취하십시오.

고체 자당을 첨가하고 혼합하여 용액의 밀도를 높입니다.

그것을 옮기고 원심분리하여 파편에서 밀도가 높은 단백질을 분리합니다.

상청액을 버리고 펠릿을 더 높은 자당 농도 완충액에 재현탁하고 혼합하고 원심분리합니다.

몇 개의 아밀로이드 원섬유를 포함하는 최상층을 새 튜브에 모으고 세척 완충액을 첨가하고 혼합합니다.

이제 중간층을 버리고 아밀로이드 원섬유가 풍부한 펠릿을 최대 분리를 위해 최상층 분획이 포함된 튜브로 옮깁니다.

결합된 분획을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 분해 완충액을 첨가하고 배양하여 비아밀로이드 단백질만 분해합니다.

원

심분리하여 상층액을 제거합니다. 펠릿을 세척하여 잔여 소화된 단백질을 제거합니다.

나머지 비아밀로이드 단백질을 가용화하는 세제가 포함된 자당 기반 가용화 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.

원심분리하여 상층액을 제거하고 분리된 아밀로이드 원섬유를 재현탁합니다.

6-8개의 세라믹 비드와 새로 준비된 얼음처럼 차가운 균질화 완충액이 들어 있는 2밀리리터 튜브에 새로 해부 또는 급속 냉동된 뇌 조직 영역을 넣는 것으로 시작합니다. 그런 다음 비드 밀 균질화기를 사용하여 4,000RPM에서 30초 온/오프 펄스의 두 주기로 조직을 분쇄합니다. 이제 15밀리리터 튜브에 1밀리리터의 뇌 조직 균질화액 1밀리리터에 얼음처럼 차가운 균질화 완충액 9밀리리터를 넣고 실험실 왁스 필름 스트립으로 밀봉합니다.

강력한 가용화를 보장하려면 튜브를 섭씨 4도에서 밤새 회전시키십시오. 다음날, 조직 추출물 현탁액에 고체 자당을 1.2몰의 최종 농도로 첨가합니다. 잘 섞어 250,000배g으로 섭씨 4도에서 45분간 원심분리한다. 상청액을 버린 후, 분쇄하여 1.9몰 자당을 함유하는 균질화 완충액 2밀리리터에 펠릿을 재현탁하고 섭씨 4도에서 45분 동안 125,000배 g으로 원심분리한다.

원심분리 후, 상단의 백색 고체 층을 신선한 튜브로 옮기고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 얼음처럼 차가운 세척 완충액 1밀리리터에 가용화합니다. 펠릿에는 아밀로이드 원섬유도 풍부하기 때문에 수성 중간층을 버리고 펠릿을 최상층과 결합하여 더 높은 수율을 얻습니다. 결합된 분획을 섭씨 4도에서 20분 동안 8,000배 g으로 원심분리합니다.

상청액을 버린 후, 펠릿을 얼음처럼 차가운 분해 완충액 1밀리리터에 재현탁하고 와중에