운동 뉴런 용해물에서 표적 단백질-DNA 복합체의 면역침전(Immunoprecipitation of Target Protein-DNA complexes from Motor Neuron Lysate)

DNA에 가교된 표적 단백질에 특이적인 항체로 코팅된 전처리된 마그네틱 비드가 들어 있는 튜브로 시작합니다.

DNA 단편을 포함하는 운동 뉴런 용해물을 추가하고 교반하면서 배양합니다.

DNA 단편은 항체로 코팅된 비드와 상호 작용하여 비드-DNA 복합체를 형성합니다.

원심분리기로 캡에서 액체를 수집하고 자기 분리기에 올려 비드-DNA 복합체를 침전시킵니다.

결합되지 않은 DNA 단편을 포함하는 상청액을 제거합니다.

세제 기반 용해 완충액을 도입하여 비특이적으로 결합된 DNA 단편을 가용화합니다.

원심분리하여 자기 분리를 수행한 다음 상층액을 제거합니다.

비특이적 상호 작용을 방해하기 위해 고염 완충액으로 세척하십시오. 원심분리하고 자기 분리를 수행하고 상층액을 제거합니다.

LiCl 완충액으로 세척하여 나머지 비특이적 상호 작용을 제거합니다. 원심분리하고 자기 분리를 수행하고 상층액을 제거합니다.

마지막으로 Tris-HCl 완충액으로 세척하고 원심분리한 후 자기 분리를 수행합니다.

상청액을 제거하고 표적 단백질-DNA 복합체를 포함하는 비드를 수집합니다.

염색질 면역침전을 시작하려면 항체 코팅 비드를 차단 용액 1밀리리터로 세척합니다. 항체 코팅 비드가 들어 있는 튜브를 섭씨 4도의 흔들리는 플랫폼에 5분 동안 놓습니다. 잠시 회전시킨 후 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 상청액을 제거합니다.

항체 코팅된 비드를 50마이크로리터의 차단 용액에 재현탁합니다. 항체 코팅 비드에 초음파 처리 된 용해물 1 밀리리터를 첨가하십시오. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도의 흔들리는 플랫폼에서 밤새 배양합니다. 샘플을 밤새 배양한 후 튜브를 잠시 회전시켜 캡에서 액체를 수집합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 선반에 놓고 1분 후 피펫으로 상청액을 조심스럽게 제거합니다.

다음으로 다음과 같이 일련의 세탁을 수행합니다. CPI가 함유된 냉세척 완충액 1밀리리터를 샘플에 첨가합니다. 샘플을 섭씨 4도의 흔들림 플랫폼에서 5분 동안 혼합합니다. 샘플 튜브를 잠시 돌립니다. 그런 다음 마그네틱 랙에 놓습니다. 1분 후 피펫으로 상청액을 제거합니다.