소뇌 오가노이드 절편의 형광 면역 염색

뚜렷한 유형의 소뇌 뉴런을 포함하는 고정된 소뇌 오가노이드 절편을 가져 가십시오.

잔류 포매 배지를 제거하기 위해 완충액에서 절편을 세척합니다.

글리신에서 배양하여 잔류 반응성 부위가 고정되지 않도록 차단하여 면역염색 중 비특이적 결합을 줄입니다.

세포를 투과화하기 위해 비이온성 세제를 첨가하십시오.

완충액으로 씻고 여분의 세제를 제거합니다.

이제 슬라이드를 말리십시오. 조직 건조를 방지하기 위해 완충액을 적신 종이가 있는 면역염색 접시에 옮깁니다.

뉴런의 비특이적 부위에 결합하는 차단 용액을 적용합니다.

차단 용액을 제거합니다. 소뇌 뉴런 내의 표적 항원에 결합하는 1차 항체와 함께 배양합니다.

완충액으로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

형광단 결합 2차 항체와 함께 배양하여 항원 결합 1차 항체에 결합합니다.

그런 다음 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

세포핵을 염색하기 위해 염료를 첨가하십시오.

형광 현미경을 사용하여 소뇌 뉴런에서 발현되는 마커를 시각화하여 오가노이드 성숙을 나타냅니다.

오가노이드 절편이 포함된 현미경 슬라이드를 50밀리리터의 1X PBS로 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 슬라이드를 신선한 1X PBS가 들어 있는 Coplin 용기로 옮깁니다. 슬라이드를 새로 준비된 글리신 50밀리리터가 들어 있는 Coplin 용기에 옮기고 실온에서 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 슬라이드를 0.1% Triton 50밀리리터가 들어 있는 Coplin 용기에 옮기고 실온에서 10분 동안 투과화합니다. 슬라이드를 1X PBS로 매번 5분 동안 두 번 세척합니다. 1X PBS에 적신 3mm 종이로 면역염색 접시를 준비합니다.

슬라이스 주위에 티슈로 슬라이드를 말리고 3mm 종이 위에 놓습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 슬라이드를 0.5밀리리터의 차단 용액으로 덮습니다. 실온에서 30분 동안 배양한 후 과도한 차단 용액을 제거하고 슬라이스 주위에 티슈로 슬라이드를 건조시킵니다.

각 슬라이드에 50마이크로리터의 희석된 1차 항체를 놓고 커버슬립으로 덮습니다. 슬라이드를 미리 준비된 면역염색 접시에 넣고 섭씨 4도에서 배양합니다.

하룻밤 배양 후, 슬라이드를 50 밀리리터의 TBST가 담긴 Coplin 병으로 옮겨 커버슬립이 떨어지도록 한 다음 슬라이드를 TBST로 매번 5분 동안 세 번 세척합니다. 각 슬라이드에 50마이크로리터의 희석된 2차 항체를 놓고 커버슬립으로 덮습니