이중 염색을 통한 소뇌 뉴런 배양에서 신경 세포 생존력 평가

신경교세포 성장을 억제하는 항유사분열제로 처리된 배양판으로 시작하여 주로 소뇌 과립 뉴런과 소수의 신경교세포를 남깁니다.

배지를 제거하고 차가운 인산염 완충 식염수 또는 PBS를 천천히 첨가하여 세포 생존력을 유지합니다.

완충액을 콜드 염색 혼합물로 교체하고 배양합니다.

이 혼합물에는 비형광 화합물인 플루오레세인 디아세테이트 또는 FDA와 막 불투과성 형광 염료인 요오드화 프로피듐 또는 PI가 포함되어 있습니다.

FDA는 세포로 확산되며, 살아있는 세포의 기능성 에스테라아제는 이를 녹색 형광 화합물로 전환합니다.

PI는 손상된 막을 통해 죽은 세포에 들어가 DNA에 결합하고 적색 형광을 방출합니다.

염색액을 제거하고 차가운 PBS를 첨가하여 세포가 건조되는 것을 방지합니다.

FDA 및 PI 염색에 대한 형광 이미지와 위상차 이미지를 얻습니다. FDA 및 PI 이미지를 병합합니다.

그런 다음 이 형광 이미지를 위상차 이미지와 비교하면 큰 신경교세포를 배제하는 데 도움이 됩니다.

빨간색 형광은 신경 세포 사멸을 나타내는 반면 녹색 형광은 신경 생존 가능성을 나타냅니다.

10밀리리터의 PBS에 플루오레세인 디아세테이트를 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도로 혼합하고 요오드화 프로피듐을 밀리리터당 50마이크로그램의 최종 농도로 혼합하여 염색을 시작합니다. FDA PI 용액을 소용돌이치게 혼합하고 얼음 위에 놓습니다. 배양 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.

피펫 팁으로 세포를 만지지 않고 배양 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 그런 다음 차가운 PBS를 천천히 첨가합니다. PBS를 흡인한 다음 차가운 FDA PI 또는 FDA PI Hoechst 작업 용액을 추가합니다. 접시를 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 다음으로, FDA PI 또는 FDA PI Hoechst 작업 용액을 흡인한 후 각 웰에 차가운 PBS를 추가합니다.

형광 현미경이 올바르게 설정되었는지 확인하십시오. 100-300밀리초 사이의 노출 시간과 2.8X의 아날로그 이득을 사용하여 각각 520, 620 및 460나노미터에서 FDA PI 및 Hoechst의 형광 방출을 검출합니다. 형광 이미지를 수집한 후 위상차 모드를 사용하여 일반 조명 아래에서 이미지를 촬영합니다.

FDA PI 이중 염색의 경우 그래픽 편집 소프트웨어에서 FDA 양성 레이어를 PI 양성 레이어 위로 드래그하여 세포 이미지를 오버레이합니다. 레이어 패널의 불투명도 필드에 50%를 입력하여 FDA 양성 레이어의 불투명도를 조정합니다. 레이어 메뉴를 열고 보이 는 병합 버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다. 이미지(Image), 조정(Adjustments), 밝기/대비(Brightness/Contrast) 아래의 대비 필드에 50을 입력하여 오버레이된 이미지의 대비를 설정합니다. 오버레이 이미지에 FDA 및 PI 이중 양성 세포가 없는지 확인합니다.

FDA PI Hoechst 삼중 염색의 경우, 다시 FDA 양성 층을 PI 양성 층으로 드래그하고 FDA 양성 층의 불투명도를 조정한 다음 이전과 같이 이미지를 병합하여 세포의 이미지를 오버레이합니다. 그런 다음 병합된 레이어에서 Hoechst-positive 레이어를 드래그합니다.

레이어 패널의 불투명도 필드에 50%를 입력하여 Hoechst-positive 레이어의 불투명도를 조정하고 레이어 메뉴를 열고 표시 병합 버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다. 형광 모드에서 촬영한 이미지와 위상차 모드에서 촬영한 이미지를 비교하여 크고 불규칙한 신경교세포와 소뇌 과립 뉴런을 시각적으로 구별합니다.