Immunostaining을 통한 초파리 뇌의 버섯체 뉴런 시각화

야생형 및 돌연변이 초파리 뇌를 고정제와 세제가 들어 있는 용액에 넣습니다. 부드럽게 흔들면서 배양합니다.

고정제는 조직 형태를 보존하고 세제는 세포막을 투과시킵니다.

뇌가 가라앉도록 한 다음 용액을 제거하십시오.

완충액으로 티슈를 씻으십시오.

비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 용액을 첨가하십시오.

용액을 제거하고 뇌의 버섯체 또는 MB 뉴런에서 축삭 발달을 조절하는 특정 단백질을 표적으로 하는 1차 항체를 추가합니다.

항체 결합을 촉진하기 위해 배양합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

1차 항체를 표적으로 하는 형광단 접합 2차 항체와 함께 배양합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 다시 세척한 다음 뇌를 마운팅 배지에 재현탁합니다.

브릿지 슬라이드에 뇌를 장착하고 형광 현미경으로 시각화합니다.

야생형과 비교하여 돌연변이 뇌는 축삭 잘못된 투영과 MB 엽 누락과 함께 결함이 있는 표현형을 나타냅니다.

현미경 아래에서 P200 피펫을 사용하여 동일한 유전자형에서 10-15개의 해부된 뇌를 PTN에 희석된 4% 파라포름알데히드로 채워진 0.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 실온에서 천천히 흔들면서 뇌를 20분 동안 배양합니다. 고정 후 뇌가 튜브 바닥에 가라앉도록 한 다음 고정제를 제거합니다.

다음으로, 세척당 500마이크로리터의 PTN으로 두 번 빠른 세척을 수행합니다. 뇌가 튜브에 정착하는 즉시 PTN을 교환하십시오. 다음으로, 실온에서 부드럽게 교반하여 PTN으로 3회 긴 세척을 수행합니다.

이러한 세척 후 뇌는 PTN에서 섭씨 4도에서 밤새 보관될 수 있습니다. 마지막 PTN 세척을 제거한 후, 뇌를 0.5밀리리터의 차단 용액에 실온에서 최소 30분 동안 부드럽게 교반하면서 배양합니다. 차단액을 제거한 후 차단액에 희석한 1차 항체를 첨가하고, 뇌를 섭씨 4도에서 2일 동안 부드럽게 교반하면서 배양한다.

5-세척 PTN 세척 요법을 사용하여 1차 항체를 제거한 다음 2차 항체를 적용합니다. 이 항체를 실온에서 3시간 동안 조직과 함께 배양한 채 흔들면서 빛으로부터 보호합니다.

2차 항체 용액에서 뇌를 배양한 후, PTN 세척 연대를 적용하고 각 세척 후 샘플을 호일로 덮고 가능한 한 많은 완충액을 제거하여 마무리합니다. 그런 다음 75마이크로리터의 형광 퇴색 방지 마운팅 매체를 추가하고 뇌와 배지를 피펫 팁 안팎으로 한 번만 흐르게 합니다.