마우스 뇌 절편에서 증식된 신경 줄기세포를 시각화하기 위한 면역형광 염색

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티미딘 유사체인 EdU로 표지된 증식된 신경 줄기 세포를 포함하여 신경 세포를 포함하는 고정된 마우스 뇌 절편을 채취합니다.

용액 확산을 방지하기 위해 소수성 표시로 섹션의 윤곽을 그립니다.

조직을 투과화하기 위해 세제를 첨가하십시오. 여분의 세제를 제거하기 위해 씻으십시오.

형광단을 추가하여 EdU를 라벨링합니다. 과도한 형광단을 제거합니다.

형광 현미경을 사용하여 EdU 표지 세포의 적절한 염색을 확인합니다.

비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 단백질을 포함하는 차단 완충액을 적용합니다. 과도한 단백질을 제거하십시오.

신경 줄기 세포의 특정 단백질에 결합하는 1차 항체와 함께 배양합니다. 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

형광단 접합 2차 항체를 첨가하여 1차 항체에 결합합니다. 결합되지 않은 항체를 씻어냅니다.

염료로 핵을 염색하고 여분의 염료를 제거합니다.

소수성 표시를 제거하고 마운팅 매체를 도포한 다음 커버슬립을 놓습니다.

공초점 현미경을 사용하여 절편을 관찰하여 표지된 신경 줄기 세포를 시각화합니다.

티미딘 유사체로 조직 절편을 염색하려면 구연산염 완충액에서 조직 절편을 제거합니다. 소수성 펜으로 테두리를 그리기 전에 조직 절편을 건조시키고 슬라이드에 완전히 부착하십시오. 다음으로, 투과화 완충액으로 절편을 20-30분 동안 투과화합니다. TBS Triton을 사용하여 매번 5분 동안 절편을 두 번 세척합니다. 그런 다음 EdU 반응 용액을 준비합니다.

EdU 반응 용액에서 절편을 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 TBS Triton에서 매번 5분씩 세 번 세척합니다. 이 단계에서 형광 현미경을 사용하여 EdU 반응이 작동하는지 확인합니다. 반응이 작동하는지 EdU 표지 세포를 관찰해야 합니다. 이제 2차 항체와 동일한 동물에서 증가된 차단 완충액을 사용하여 30분에서 1시간 동안 장착된 조직 절편을 차단합니다. 그런 다음 TBS Triton에서 매번 5분씩 두 번 세탁합니다.

차단 단계에서 차단 완충액에 1차 항체를 혼합하여 1차 항체 용액을 제조합니다. 그런 다음 슬라이드당 250마이크로리터의 1차 항체 용액을 추가하여 조직 절편이 완전히 잠기도록 하고 실온에서 밤새 배양합니다. 다음날 조직 절편을 TBS Triton에서 각각 5분 동안 세 번 세척하여 과도한 1차 항체를 제거합니다.

그런 다음 실온에서 2시간 동안 차단 완충 용액에서 제조된 형광단 접합 2차 항체에서 조직 절편을 배양합니다. 조직 절편을 TBS Triton에서 각각 5분 동안 세 번 세척하여 과도한 2차 항체를 제거합니다. 다음으로, 300마이크로몰 DAPI 용액을 PBS에서 1-100으로 실온에서 15분 동안 도포합니다. 그런 다음 조직 절편을 PBS에서 각각 5분 동안 세 번 세척하여 과도한 DAPI를 제거하고 면봉을 사용하여 조직 주위의 PAP 펜 원을 제거합니다. 마운팅 매체를 적용하고 커버슬립으로 덮기 전에 섹션을 건조시키십시오.

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