Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

0 views • 3:45 min • July 8th, 2025

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무혈청 배지에서 원하는 플라스미드를 섭취하십시오. 이 플라스미드는 형광 태그가 있는 소포 특이적 단백질을 암호화합니다.

다른 튜브에서 무혈청 배지에 희석된 형질감염 시약을 섭취합니다.

두 용액을 혼합하고 배양합니다.

형질감염 시약은 플라스미드와 결합하여 복합체를 형성합니다.

혈청과 함께 배지에 부착 뉴런이 포함된 우물을 섭취하십시오. 복합체를 추가하고 배양합니다. 복합체는 플라스미드가 세포로 진입하는 것을 용이

하게 합니다.

내재화되지 않은 복합체를 제거하기 위해 매체를 폐기하십시오.

신선한 배지를 추가한 다음 배양합니다.

플라스미드는 전사될 핵으로 들어간 다음 뉴런의 소포를 표지하는 소포 특이적 형광 단백질로 번역됩니다.

제어된 온도에서 형광 현미경을 사용하여 지정된 시간 간격으로 이미지를 획득합니다.

이미지를 분석하려면 추적 매개변수를 정의합니다.

관심 있는 소포를 식별하고 각 이미지에 좌표를 기록합니다.

소포의 움직임을 시각화하기 위해 데이터를 컴파일합니다.

이 절차에서는 플라스미드 4마이크로그램을 무혈청 배지 200마이크로리터와 혼합합니다. 별도의 튜브에서 8마이크로리터의 형질감염 시약을 200마이크로리터의 무혈청 배지에 희석합니다. 그런 다음 용액을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후, 플라스미드 용액과 형질감염 시약 용액을 혼합하고 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 코팅된 유리 바닥 접시에 혼합물을 추가합니다.

뉴런을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 배지를 2밀리리터의 대뇌 피질 배양 배지로 교체하고 뉴런을 섭씨 37도에서 1-2일 동안 배양합니다.

이미징을 위해서는 40x 대물 렌즈가 장착 된 CCD 카메라가 장착 된 형광 현미경을 사용하십시오. 배양 시스템을 사용하여 온도를 섭씨 37도로 유지합니다. 이미지 획득 소프트웨어로 제어되는 100초 동안 5초마다 1프레임의 뉴런 이미지를 획득합니다.

이미지를 분석하려면 수동 추적을 사용하여 ImageJ 소프트웨어에서 모든 순차 이미지를 엽니다. 순차 이미지를 결합하려면 [Image]를 선택한 다음 [Stacks]를 선택한 다음 [Images to Stack]을 차례로 선택한 다음 [OK]를 클릭합니다. 그런 다음 [Plugins]를 선택한 다음 [Manual Tracking]을 선택합니다. 추적 창이 나타납니다. Show Parameters(매개변수 표시) 확인란을 클릭하고 매개변수 섹션에서 추적 매개변수를 정의합니다.

그런 다음 트랙 추가를 클릭하여 새 트랙을 시작합니다. 관심 소포를 결정한 후 순차 이미지에서 신호의 중심을 클릭하여 XY 좌표를 기록합니다. 이 절차를 반복하여 모든 순차 이미지에서 소포의 XY 좌표를 수집합니다. 각 이미지는 기준점을 선택한 후 자동으로 연속 이미지로 이동합니다.

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Last updated: 18 July 2026