인간 배아 줄기 세포에서 도파민 신경 세포 오가노이드 생성

인간 배아 줄기 세포(hESC)를 세포외 기질로 코팅된 플라스크에 담아 복용합니다.

배지를 신경 유도 배지로 교체하고 배양하여 hESC를 신경 전구 세포(NPC) 콜로니로 분화시킵니다.

콜로니를 해리시키기 위해 효소 용액을 첨가하십시오.

원심분리하고 상청액을 제거한 다음 NPC 분화를 지원하기 위해 성장 인자가 포함된 유도 배지에 세포를 재현

세포 현탁액을 역피라미드 모양의 마이크로웰에 첨가하여 3차원 신경구를 형성합니다.

성장 인자와 소분자가 있는 분화 배지를 포함하는 세포외 기질 코팅 플레이트로 신경구를 옮깁니다. 도파민성 전구 뉴런으로의 분화를 촉진하기 위해 교반하에 배양합니다.

배지를 신경 성숙 배지로 교체하고 배양 웰 삽입물의 멤브레인 디스크에 신경구를 배치하여 공기와 영양분이 확산되도록 합니다.

정적 조건에서 배양하여 성숙한 도파민성 뉴런으로 구성된 3차원 오가노이드를 형성합니다.

발달 중인 뇌를 모방하는 이 오가노이드는 파킨슨병의 특징인 도파민성 뉴런 변성을 연구하는 데 유용합니다.

hESC의 다능성 특징을 유지하는 데 사용되는 줄기세포 배지를 신경 유도를 시작하기 위해 이중 SMAD 억제 칵테일을 포함하는 무혈청 배지와 다음날 계대 중 세포의 생존율을 높이기 위해 10마이크로몰 ROCK 억제제로 교체합니다. 첫째 날, 동일한 농도의 ROCK 억제제 및 이중 SMAD 억제 분자를 포함하는 무혈청 배지의 웰당 2.5밀리리터로 마이크로웰 플레이트를 준비합니다.

신경관 복부 패턴으로 세포를 분화하려면 밀리리터당 100나노그램의 SHH 및 FGF8과 2마이크로몰 평활 작용제를 추가합니다. 배지를 첨가한 후 플레이트를 1,200배 g으로 5분 동안 원심분리하여 마이크로웰에서 기포를 제거합니다. 마이크로웰 플레이트를 반분화 배지와 함께 사용할 준비가 되면 hESC 배지를 제거하고 염화칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS로 빠르게 세척합니다.

T75 플라스크에 7.5mL의 재조합 효소 용액을 첨가하여 콜로니를 단일 세포 현탁액으로 해리시킵니다. 세포를 섭씨 37도에서 2분 동안 배양한 다음 DMEM F-12 7.5를 첨가합니다. 그 후, 세포 현탁액을 수집하고 300배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 제거하고 마이크로웰 플레이트를 준비하는 데 사용된 것과 동일한 배지에서 세포를 계산합니다.

2.5밀리리터의 배지에 470만 개의 세포를 준비하고 플레이트에 이미 놓인 이전 2.5밀리리터의 배지에 첨가함으로써 마이크로웰당 1,000개의 세포를 포함하는 신경구를 형성할 수 있도록 배지 부피를 조정합니다. 각 마이크로웰에 세포를 올바르게 분배시키려면 플레이트를 부드럽게 흔들고 300배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하여 구체를 생성합니다.

둘째 날에 마이크로웰을 배지로 부드럽게 세척하고 조직 처리된 6웰 플레이트에 구체를 옮깁니다. 구체를 섭씨 37도에서 회전시켜 놓고 2-3일마다 배지의 절반을 신선한 배지로 교체합니다. 3일에서 13일째에 신경 유도를 강화하고 중뇌 정체성을 가진 신경 전구 세포로 전환하기 위해 배지에 3마이크로몰 GSK-3-베타 억제제를 보충합니다. 샘플을 두 개의 새로운 조직 처리된 6개의 웰 플레이트로 분할하여 구 밀도를 줄이고 구 응집을 방지합니다.

8일째에 성장 인자가 있는 새로운 배지로 전환하여 신경 성숙을 시작하고 2-3일마다 배지를 교체합니다. 21일째에 새로운 6웰 플레이트의 한 웰에 배양 플레이트 삽입물 1개를 넣고 멤브레인 삽입물 아래에 신경권 분화에 사용되는 신경 성숙 배지 1.2밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 PTFE 멤브레인을 배양 플레이트 인서트에 배치합니다.

마지막으로, 신경 오가노이드를 생성하기 위해 PTFE 멤브레인의 공기-액체 계면 조건에서 약 100개의 신경구를 시드합니다. 이 단계에서 회전을 중지하고 필요한 분화 시점에 도달할 때까지 2-3일마다 배지를 교체합니다.