신경전구세포와 뉴런에서 시알로글리코단백질의 면역형광 염색

시알산 리포터에 의해 태그된 시아로글리코단백질이 있는 일차 신경 줄기 및 전구 세포와 뉴런을 예로 들어 보겠습니다.

파라포름알데히드를 첨가하여 세포를 고정합니다. 완충액을 사용하여 과도한 파라포름알데히드를 제거합니다.

비오틴 기반 화학 프로브, 환원제 및 금속 기반 촉매를 포함하는 반응 혼합물과 함께 배양합니다.

환원제는 촉매를 활성화하여 시올로글리코단백질의 비오티닐화를 촉진합니다.

반응 혼합물을 제거하고 완충액으로 세척합니다. 형광단 접합 스트렙타비딘을 첨가하여 비오티닐화된 시탈로글리코단백질에 결합합니다.

결합되지 않은 스트렙타비딘을 제거하고 완충액으로 세척합니다. 단백질과 비이온성 세제를 첨가하여 비특이적 부위를 차단하고 세포를 투과시킵니다.

이 용액을 제거하고 특정 세포 단백질을 표적으로 하는 1차 항체와 함께 배양합니다.

결합되지 않은 항체를 제거합니다.

형광단 태그가 지정된 2차 항체 및 형광 염료와 함께 배양하여 단백질 결합 1차 항체에 결합하고 핵을 표지합니다.

결합되지 않은 분자를 제거합니다. 완충액으로 씻으십시오.

형광 현미경을 사용하여 세포를 이미지화하여 형광 sialoglycoproteins 및 세포 단백질을 시각화합니다.

먼저 공배양 플레이트에서 인서트를 제거하고 웰 바닥에서 배양 배지를 흡인합니다. 다음으로, 예열된 PBS로 신경 세포를 한 번 세척합니다. 웰에서 PBS를 흡인하고 PBS에 미리 냉각된 4% 파라포름알데히드 1밀리리터를 각 웰에 첨가합니다.

세포를 실온에서 10분 동안 고정합니다. 그런 다음 미리 냉각된 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. PBS를 흡인하고 새로 준비된 비오틴 접합 완충액 I 1밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, 웰에서 반응 완충액을 흡인하고 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 세포의 각 웰에 염색 완충액 1밀리리터를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 웰에서 염색 완충액을 흡인하고 미리 냉각된 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 세포의 각 웰에 1밀리리터의 차단 완충액을 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 웰에서 차단 완충액을 제거하고 각 웰에 1밀리리터의 1차 항체 용액을 추가합니다. 세포를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

다음날 웰에서 1차 항체 용액을 제거합니다. 미리 냉각된 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 웰에서 PBS를 흡인하고 각 웰에 1밀리리터의 2차 항체를 추가합니다. 세포를 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 그 후, 웰에서 용액을 흡인하고 미리 냉각된 PBS로 세포를 세 번 세척합니다.