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신경과학
0 조회수 • 3:18 분 • July 8th, 2025
배지에 마우스 배아의 뉴런을 포함하는 다중 웰 배양 슬라이드로 시작합니다.
뉴런은 성장하는 축삭의 끝에 성장 원뿔을 나타냅니다. 이러한 구조에는 사상체증이라고 하는 얇은 돌기와 세포골격의 구성 요소인 액틴 필라멘트와 미세소관으로 구성된 층측부라고 하는 시트 모양의 확장이 포함됩니다.
응집된 아밀로이드 β 또는 Aβ 단백질로 테스트 웰을 처리하고 대조군 웰을 비히클 용액으로 처리합니다.
테스트 웰에서 응집된 Aβ는 막 수용체에 결합하여 세포골격 조절 단백질을 인산화하는 다운스트림 신호 전달을 시작합니다.
인산화된 단백질은 액틴 필라멘트와 미세소관을 파괴하여 성장 원뿔의 구조적 무결성을 불안정하게 만들고 붕괴를 유발합니다.
세포 구조를 보존하기 위해 고정액과 함께 배양한 다음 세포를 세척하고 이미징을 위해 장착합니다.
현미경을 사용하여 테스트 및 제어 웰의 세포 구조를 비교합니다.
Aβ 처리 뉴런에서 성장 원뿔 붕괴의 증가는 Aβ 응집체의 독성 효과를 나타냅니다.
상업적으로 얻은 전장 A-베타-42의 새로운 바이알을 열고 내용물을 멸균 증류수에 0.5밀리몰 농도로 용해시켜 최소 일주일 전에 이 분석을 시작합니다. 응집 및 독성을 유도하기 위해 섭씨 37도에서 7일 동안 배양합니다. 응집된 A-베타-42의 분취량을 준비하고 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.
신경 배양 4일째에 이전에 입증된 대로 1시간 동안 1시간 동안 0.5마이크로몰 응집 A-베타-42 또는 비히클 용액 100마이크로리터로 웰을 처리합니다. 시간이 경과한 후 배양액을 제거하고 즉시 PBS에 4% 자당을 함유한 4% 파라포름알데히드로 뉴런을 핫플레이트에 섭씨 37도에서 1시간 동안 고정시킵니다.
성장 원뿔의 모양을 유지하는 것이 이 프로토콜에 매우 중요하기 때문에 고정이 가장 중요합니다.
고정 후 뉴런을 PBS로 세 번 세척합니다. 그런 다음 챔버를 제거한 후 수성 장착 매체로 뉴런을 장착합니다. 마운팅 매체를 섭씨 4도에서 2-4일 동안 건조시킵니다. 도립 현미경에서 20x 건식 대물 렌즈로 각 웰의 전체 영역을 캡처합니다.
각 유정의 전체 영역을 캡처하고 분석하는 것은 주관성을 피하는 데 중요합니다.
3단계 또는 4단계에서 각 뉴런의 가장 긴 신경돌기를 축삭으로 분류합니다. lamellipodia가 없거나 filopodia가 3개 미만인 축삭 성장 원뿔은 붕괴된 성장 원뿔로 간주됩니다.