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신경과학
0 조회수 • 4:53 분 • July 8th, 2025
형광 태그가 있는 시냅스피신 및 시냅토타그민-1을 포함하여 시냅스 소포막 단백질을 발현하는 배양 뉴런이 포함된 커버슬립으로 시작합니다.
배지를 제거하고 탈분극 완충액과 1차 항체의 혼합물을 첨가한 다음 배양합니다.
완충 이온은 세포에 들어가 시냅스 소포와 막의 융합을 자극하여 시냅토타그민-1을 노출시킵니다.
1차 항체는 노출된 시냅토타그민-1에 선택적으로 결합합니다.
완충액을 버리고 배지로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
신선한 배지를 도입하고 배양하여 막 내재화를 촉진하여 표지된 시냅토피신과 항체 결합 시냅토타민-1로 재활용 소포를 형성합니다.
배지를 제거하고 세포를 고정하고 세척합니다.
형광단 결합 2차 항체가 있는 세제 기반 차단 완충액을 도입합니다.
세제는 세포를 투과화하여 2차 항체가 항체 결합 시냅토타민-1과 상호 작용할 수 있도록 합니다.
커버슬립을 들어 올려 물로 씻은 후 말리십시오.
이중 표지된 재활용 소포의 광학 분석을 위해 포매 매체가 있는 슬라이드에 커버슬립을 뒤집어 놓습니다.
600마이크로리터의 1x 탈분극 완충액과 10밀리리터의 세포 배양 배지를 수조에서 섭씨 37도로 예열합니다. 1 마이크로리터의 마우스 항-SYT1 항체를 1x 탈분극 완충액에 넣고 10초 동안 소용돌이치게 합니다. 세포에서 세포 배양 배지를 제거하고 폐기한 후, 각 웰에 200마이크로리터의 탈분극 항체 혼합물을 첨가합니다.
인큐베이터에서 섭씨 37도 및 5% CO2에서 플레이트를 5분 동안 배양합니다. 탈분극 항체 혼합물을 제거하고 폐기하고 세포 배양 배지로 세포를 세 번 세척합니다. 각 웰에 1밀리리터의 세포 배양 배지를 넣고 실온에서 30초 동안 배양합니다.
그런 다음 750마이크로리터의 배지를 제거하고 같은 양의 신선한 배지를 추가합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다. 다음으로, 세포 배양 배지를 제거하고 폐기하고 1x PBS에 300마이크로리터의 4% PFA를 첨가합니다.
마지막으로, 섭씨 4도에서 20분 동안 배양한 후 PBS 1개로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 2차 형광단 결합 항체를 각 웰에 대해 200마이크로리터의 차단 완충액으로 1 내지 1,000의 희석으로 희석합니다. 배양된 뉴런이 있는 커버슬립이 포함된 각 웰에서 1x PBS를 제거하고 폐기합니다.
각 웰에 200마이크로리터의 블로킹 완충액 항체 혼합물을 첨가하고 실온에서 60분 동안 배양합니다. 배양 후, 1x PBS 1밀리리
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