Preparing Cultured Neurons for Optical Analysis of Recycled Synaptic Vesicles(재활용된 시냅스 소포의 광학 분석을 위한 배양 뉴런 준비)

형광 태그가 있는 시냅스피신 및 시냅토타그민-1을 포함하여 시냅스 소포막 단백질을 발현하는 배양 뉴런이 포함된 커버슬립으로 시작합니다.

배지를 제거하고 탈분극 완충액과 1차 항체의 혼합물을 첨가한 다음 배양합니다.

완충 이온은 세포에 들어가 시냅스 소포와 막의 융합을 자극하여 시냅토타그민-1을 노출시킵니다.

1차 항체는 노출된 시냅토타그민-1에 선택적으로 결합합니다.

완충액을 버리고 배지로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

신선한 배지를 도입하고 배양하여 막 내재화를 촉진하여 표지된 시냅토피신과 항체 결합 시냅토타민-1로 재활용 소포를 형성합니다.

배지를 제거하고 세포를 고정하고 세척합니다.

형광단 결합 2차 항체가 있는 세제 기반 차단 완충액을 도입합니다.

세제는 세포를 투과화하여 2차 항체가 항체 결합 시냅토타민-1과 상호 작용할 수 있도록 합니다.

커버슬립을 들어 올려 물로 씻은 후 말리십시오.

이중 표지된 재활용 소포의 광학 분석을 위해 포매 매체가 있는 슬라이드에 커버슬립을 뒤집어 놓습니다.

600마이크로리터의 1x 탈분극 완충액과 10밀리리터의 세포 배양 배지를 수조에서 섭씨 37도로 예열합니다. 1 마이크로리터의 마우스 항-SYT1 항체를 1x 탈분극 완충액에 넣고 10초 동안 소용돌이치게 합니다. 세포에서 세포 배양 배지를 제거하고 폐기한 후, 각 웰에 200마이크로리터의 탈분극 항체 혼합물을 첨가합니다.

인큐베이터에서 섭씨 37도 및 5% CO₂에서 플레이트를 5분 동안 배양합니다. 탈분극 항체 혼합물을 제거하고 폐기하고 세포 배양 배지로 세포를 세 번 세척합니다. 각 웰에 1밀리리터의 세포 배양 배지를 넣고 실온에서 30초 동안 배양합니다.

그런 다음 750마이크로리터의 배지를 제거하고 같은 양의 신선한 배지를 추가합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다. 다음으로, 세포 배양 배지를 제거하고 폐기하고 1x PBS에 300마이크로리터의 4% PFA를 첨가합니다.

마지막으로, 섭씨 4도에서 20분 동안 배양한 후 PBS 1개로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 2차 형광단 결합 항체를 각 웰에 대해 200마이크로리터의 차단 완충액으로 1 내지 1,000의 희석으로 희석합니다. 배양된 뉴런이 있는 커버슬립이 포함된 각 웰에서 1x PBS를 제거하고 폐기합니다.

각 웰에 200마이크로리터의 블로킹 완충액 항체 혼합물을 첨가하고 실온에서 60분 동안 배양합니다. 배양 후, 1x PBS 1밀리리터로 세포를 5분 동안 세 번 세척합니다.

다음으로, 현미경 슬라이드에 7마이크로리터의 포매 배지 방울을 추가합니다. 24웰 플레이트에서 커버슬립을 캐뉼라로 들어 올리고 집게로 잡아 제거합니다. 커버슬립을 증류수에 담가 PBS를 제거하고 한쪽 가장자리를 부드러운 티슈에 대고 조심스럽게 건조시킵니다.

커버슬립을 포매 배지 방울 위로 넘겨 세포를 운반하는 표면이 현미경 슬라이드를 향하도록 하여 세포를 포매 배지에 포매시킵니다. 슬라이드를 후드 아래에서 1-2시간 동안 건조시키고 빛 노출을 피하기 위해 덮습니다. 건조된 슬라이드를 섭씨 4도의 현미경 슬라이드 상자에 보관합니다.