Alpha-Synuclein 응집체로 처리된 뉴런의 면역염색

잘못 접힌 단백질의 덩어리인 알파-시누클레인 또는 알파-S 응집체로 처리된 부착 뉴런 배양으로 시작합니다.

이 덩어리는 응집되어 세포내 봉입물을 형성합니다.

세포 무결성을 보존하기 위해 배지를 고정 용액으로 교체하십시오.

고정액을 제거하고 완충액으로 세척합니다.

다음으로, 계면활성제를 첨가하여 세포막을 투과시킵니다.

계면활성제를 제거하고 완충액으로 세척합니다.

비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 용액을 도입합니다.

이제 알파-S 포입체 및 구조 단백질에 특이적으로 결합하는 1차 항체와 함께 배양합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

형광 표지 2차 항체와 함께 배양합니다.

결합되지 않은 항체를 제거합니다.

핵에 라벨을 붙이기 위해 형광 염색을 추가합니다.

얼룩을 제거하고 완충액으로 씻으십시오.

장착 매체를 사용하여 뉴런이 있는 커버슬립을 슬라이드에 장착합니다.

형광 현미경으로 뉴런 내에서 면역 표지된 알파-S 봉입물을 관찰합니다.

화학 흄 후드에서 면역형광을 수행하려면 PBS에 2% 파라포름알데히드와 5% 자당 용액으로 뉴런을 흔들지 않고 실온에서 15분 동안 고정합니다. 15분 후 고정액을 제거하고 뉴런을 PBS로 3회 잠시 세척합니다.

다음으로, 실온에서 5분 동안 PBS에 0.3%의 비이온성 계면활성제로 뉴런을 투과화합니다. 그런 다음 뉴런을 PBS로 세 번 잠시 세척합니다. 뉴런을 PBS의 3% FBS와 함께 안와 셰이커에서 실온에서 30분 동안 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 그 후, PBS의 3% FBS에 용해된 적절한 1차 항체와 함께 뉴런을 냉장실 또는 냉장고에서 밤새 서열 셰이커에서 4도에서 밤

새 배양합니다.

다음날 항체 용액을 제거하고 PBS로 세포를 3회 잠시 세척합니다. 그런 다음 PBS의 3% FBS에 용해된 적절한 형광 2차 항체와 뉴런을 어둠 속의 실온에서 궤도 셰이커에서 1시간 동안 배양합니다.

항체 용액을 제거하고 PBS로 3회 잠시 세척합니다. 다음으로, 안와 셰이커에서 어둠 속의 실온에서 15분 동안 DAPI 용액으로 뉴런을 염색합니다. 15분 후 항체 용액을 제거하고 PBS로 3회 잠깐 세척합니다. 퇴색 방지 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다.