0 조회수 • 3:30 분 • July 8th, 2025
형질감염된 포유류 세포가 들어 있는 멀티웰 플레이트를 가져갑니다.
이 세포는 돌연변이 루시페라아제에 융합된 cAMP 결합 도메인을 포함하는 cAMP 바이오센서와 함께 G-단백질 결합 수용체인 후각 뉴런의 냄새 수용체(OR)를 발현합니다.
배지를 제거하고 완충액으로 세척하여 잔류 배지를 제거합니다.
cAMP 바이오센서 기질을 포함하는 완충액을 추가합니다. 기질이 세포로 흡수되는 것을 촉진하기 위해 배양합니다.
화학발광 플레이트 리더를 사용하여 세포의 기초 발광을 측정합니다.
웰에 농도가 증가하는 테스트 냄새 물질을 추가하고 하나의 웰을 대조군으로 처리하지 않은 상태로 둡니다.
냄새는 수술실에 결합하여 cAMP를 생성하는 신호 캐스케이드를 유발합니다.
이 cAMP는 바이오센서의 결합 도메인에 결합하여 기질과 상호 작용하여 빛을 방출하는 루시페라아제를 활성화합니다.
실시간으로발광을 측정합니다. 냄새 물질 농도가 높을수록 발광이 증가하면 냄새 물질에 의한 OR 활성화를 나타냅니다.
자극하기 전에 형질감염된 세포를 위상차 현미경으로 관찰하여 인큐베이터로 돌아가기 전에 웰당 50%에서 80%의 적절한 합류를 확인합니다. 그런 다음 Hank's Balanced Salt Solution에 10밀리몰 HEPES와 5밀리몰 포도당을 첨가하여 자극 배지를 준비합니다. 얼음 위에서 실시간 순환 AMP 분석 기질 시약 분취량의 55마이크로리터 분취량을 해동합니다.
55마이크로리터의 기질 시약과 2,750마이크로리터의 자극 매체를 혼합하여 2% 평형 용액을 준비합니다. 벤치에 종이 타월을 두껍게 펴 놓은 후 형질감염 배지가 종이 타월에 흡수되도록 접시를 종이 타월 위에 거꾸로 부드럽게 반복적으로 두드립니다. 각 웰에 50마이크로리터의 자극 배지를 피펫팅하여 세포를 세척합니다.
96웰 플레이트에서 자극 배지를 부드럽게 반복적으로 두드려냅니다. 25 마이크로리터의 2% 평형 용액을 각 웰에 피펫팅하고 어두운 곳에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 시간이 끝나기 전에 해동된 냄새 원액을 자극 매체에서 작동 농도로 희석합니다.
냄새를 첨가하기 전에 화학발광 플레이트 리더를 사용하여 플레이트의 기초 발광 수준을 측정하십시오. 플레이트 리더에서 플레이트를 빠르게 제거하고 각 웰에 25마이크로리터의 취기제 희석액을 추가합니다. 그런 다음 즉시 30분 이내에 20사이클 동안 모든 웰의 연속 발광 측정을 시작합니다.