형질전환 선충에서 프리온 유사 단백질의 세포 간 확산을 모니터링하기 위한 타임 랩스 이미징

동일한 발달 단계에서 유지되는 형질전환 선충류를 예로 들어 보겠습니다.

이 선충류의 체벽 근육 세포는 프리온 유사 단백질을 발현하며, 이는 적색 형광 단백질로 태그가 지정되고 산성 소포 내에 국한됩니다.

프리온 유사 단백질은 신경퇴행성 질환과 관련된 단백질을 잘못 접혀 응집시킵니다.

다음으로, 선충류를 고분자 나노입자와 마취액이 포함된 아가로스 패드에 옮깁니다.

나노입자와 마취액의 결합된 효과는 선충류를 아가로스 패드에 고정시킵니다.

아가로스 패드 위에 커버슬립을 놓고 밀봉합니다.

이제 선충류가 있는 아가로스 패드 어셈블리를 공초점 현미경 아래에 배치하고 적절한 이미징 매개변수를 설정합니다.

선

충류 내에서 형광 태그가 부착된 단백질의 타임랩스 이미지를 획득하여 체벽 근육 세포 내부 및 체벽 근육 세포 사이의 프리온 유사 단백질의 소포 수송을 모니터링합니다.

동봉된 텍스트 프로토콜에 따라 동기화된 C. elegans 대조군 및 프리온 도메인 형질전환 계주 및 10% 아가로스 패드를 준비한 후, 3마이크로리터의 100나노그램 폴리스티렌 비드와 3마이크로리터의 4밀리몰 레바미솔을 아가로스 패드에 피펫팅합니다. 백금 와이어 픽을 사용하여 원하는 나이의 벌레를 플레이트에서 용액으로 옮기고 커버슬립을 사용하여 덮습니다.

세포

내 수준에서 벌레를 이미지화하려면 슬라이드를 공초점 현미경의 현미경 슬라이드 홀더에 넣고 63X 또는 100X/1.4 NA 오일 대물렌즈를 사용합니다. 그런 다음 MetaMorph를 열고 "다차원 획득"을 선택한 다음 기본 탭에서 "타임랩스" 및 "저널 실행" 확인란을 선택합니다. "저장" 탭에서 파일을 저장할 디렉토리 폴더를 선택하거나 만들고 파일에 이름을 할당합니다.

"파장" 탭에서 "YokoQuad Red" 또는 MRP 이미징과 동등한 조명을 사용하고 노출을 100밀리초에서 300밀리초 사이로, 카메라 게인을 100밀리초에서 300밀리초 사이로 조정합니다. 그런 다음 "타임랩스" 탭에서 시간 간격을 1초로, "지속 시간"을 5분으로, "시점 수"를 301로 설정합니다.

저널의 "저널" 탭에서 "AFC SET Z HOLD" 및 "AFC Return to Z HOLD"를 선택합니다. 유형에서 "특수"를 두 번 선택하고 초기 지점에서 "시점 시작"과 "시점 종료"를 선택합니다. 설정이 완료되면 "획득"을 누릅니다.