신경퇴행성 질환 모델링을 위한 Rat substantia nigra에 바이러스 벡터 주입

마취된 쥐를 정위 프레임에 고정합니다.

두피를 소독하고 두개골 정중선을 절개하여 두개골을 노출시킵니다.

주사 부위를 결정하기 위해 두개골의 두 기준점인 브레그마와 람다를 식별합니다.

바이러스 벡터 현탁액이 들어 있는 미세 주입 주사기를 준비합니다.

바이러스 벡터는 신경퇴행성 질환에서 흑질 뉴런에서 잘못된 접힘 및 응집을 겪는 단백질인 알파-시누클레인을 암호화하는 전이유전자를 운반합니다.

미세 주입 펌프에 연결된 정위 기구에 주사기를 배치합니다.

주사 부위에 구멍을 뚫어 뇌 손상을 방지합니다.

바늘로 경막을 관통하고 멸균 조직으로 혈액을 청소하십시오.

미세 주입 바늘을 버 구멍을 통해 삽입하여 흑질에 도달합니다.

바이러스 현탁액을 천천히 주입하여 균일한 분포를 보장합니다.

역류를 방지하기 위해 잠시 멈춘 다음 천천히 바늘을 빼냅니다.

절개 부위를 봉합합니다.

이제 모델을 추가 분석할 준비가 되었습니다.

승인된 프로토콜에 따라 8주 된 암컷 Wistar 쥐를 적절하게 마취하는 것으로 시작합니다. 각 발을 쥐어짜고 금단 반사가 없음을 확인하여 마취의 수술 계획이 달성되었는지 확인하십시오. 다음으로, 마이크로트랜스폰더 임플란터를 사용하여 마이크로트랜스폰더를 쥐의 등에 놓습니다. 마이크로 트랜스폰더가 올바르게 배치되었는지, 판독값을 얻을 수 있는지 확인하십시오.

이제 쥐의 두피에 있는 털을 자르고 두피와 귀에 국소 마취제를 바르십시오. 쥐를 층류 후드로 옮기고 무균 기술을 사용하여 나머지 절차를 수행합니다. 이어바를 고정한 다음 입과 코 바를 고정하여 쥐를 정위 고정 프레임에 놓습니다. 체온이 떨어지지 않도록 쥐의 몸을 종이 담요로 덮으십시오. 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안구 윤활제를 바르십시오.

다음으로 승인된 절차에 따라 두피를 소독합니다. 여기에는 1% 이소프로판올에 70% 요오드가 사용됩니다. 두피 정중선을 작게 절개한 후 두개골의 막을 부드럽게 긁어내고 식염수로 헹굽니다. 두개골을 건조시킨 후 브레그마와 람다가 명확하게 보이는지 확인하십시오.

이제 10마이크로리터, 30게이지 20mm 미세주입 주사기에 재조합 AAV를 채우고 정위 고정 기기에 연결된 전동 미세주입 펌프에 놓습니다.

흑질의 도파민성 뉴런의 특이적 형질도입을 위해, 재조합 AAV 벡터는 도파민성 뉴런을 형질도입하기 위한 높은 역가와 효율성 때문에 첫 번째 선택입니다.

AAV 한 방울을 방출하여 흐름을 테스트합니다. 방출된 AAV는 다가 세제에 폐기하십시오. 헤드가 헤드 프레임에 똑바로 고정되어 있는지 육안으로 확인하십시오. 그런 다음 먼저 바늘 끝을 브레그마로 이동하고 두개골에 닿을 때까지 바늘 끝을 배복부 방향으로 내려 이 지점에서 높이를 측정하여 두개골이 평평한지 확인합니다. 람다에서 절차를 반복합니다.

바늘을 브레그마로 되돌린 후 바늘을 전후 및 내측 방향으로 미세 주입을 위한 정위 좌표로 움직입니다. 좌표를 적어보세요. 주사 부위에서 이전과 같이 두개골의 높이를 측정하고 브레그마의 높이와 0.3mm 이상 차이가 나지 않는지 확인합니다.

그런 다음 두개골에 2mm 구멍을 조심스럽게 뚫습니다. 구멍이 뚫리면 경막의 높이를 측정하여 배복부 좌표를 적용할 기준을 결정합니다. 26게이지 바늘을 사용하여 경막을 관통합니다. 멸균 조직으로 혈액을 흡수하고 모든 출혈이 멈춘 후에만 진행하십시오.

이제 미리 로드된 미세 주사 주사기의 바늘을 뇌 등쪽 복부 좌표까지 천천히 내리고 1분 동안 멈춥니다. 그런 다음 분당 0.25마이크로리터의 속도로 3마이크로리터의 AAV를 주입합니다. 주사 후 바늘을 천천히 제거하기 전에 바늘 트랙을 따라 역류하는 것을 방지하기 위해 바늘을 5분 더 제자리에 두십시오.

코팅된 꼰 폴리에스터 3.0을 사용하여 두피를 꿰매고 70% 이소프로판올에 1% 요오드로 피부를 소독하여 코와 입 바를 풀고 두 개의 이어 바를 정위 기구에서 부드럽게 제거합니다. 이때 진통제를 투여하고 필요한 경우 마취 역전제를 투여합니다. 그런 다음 쥐를 섭씨 38도로 설정된 가열판 위의 깨끗한 우리에 넣고 깨어날 때까지 면밀히 모니터링합니다.