Isolation of Detergent-Insoluble Protein Aggregates From Human Postmortem Brain Tissue

확인된 신경퇴행성 질환 사례에서 냉동된 사후 인간 뇌 조직 샘플로 시작합니다.

질병의 특징인 불용성 단백질 응집체가 풍부한 회백질을 제거하십시오.

조직을 균질화기로 옮깁니다.

억제제가 포함된 완충액을 첨가하고 균질화하여 세포내 성분을 방출합니다.

억제제는 프로테아제와 포스파타제 효소를 차단하여 단백질 분해를 방지합니다.

균질을 튜브로 옮기고 이온성 세제 완충액을 추가합니다. 인큐베이트.

제는 본질적으로 접힌 단백질을 용해하는 반면, 잘못 접힌 단백질 응집체는 그대로 유지됩니다.

세포 해리를 완료하기 위해 초음파 처리하십시오.

균질을 초원심분리기 튜브로 옮기고 고속으로 원심분리합니다.

골재는 바닥에 가라앉습니다.

세제 용해성 단백질을 함유한 상청액을 제거합니다.

이온성 세제 완충제로 응집체를 세척하고 원심분리한 후 상청액을 제거합니다.

요소 완충액을 첨가하여 단백질 응집체를 변성시켜 용해성 있게 만듭니다.

가용화 된 단백질 응집체를 튜브로 옮기고 완전히 용해되도록 잠시 초음파 처리합니다.

건강한 대조군 및 병리학적으로 확인된 AD로부터 냉동된 사후 뇌 조직을 얻습니다. 겸자와 면도날을 사용하여 각 조직 샘플에서 약 250mg의 회백질을 절제합니다. 뇌 부분이 1분 동안 해동되도록 합니다. 이제 조직 조각을 해동할 때 약 2mm 크기의 입방체 조각으로 자릅니다. 얼음 위에 미리 냉각된 2밀리리터 더스 균질화 튜브로 옮깁니다.

백질과 큰 혈관을 피하는 것을 잊지 마십시오.

빠르게 작업하고 티슈를 찢어버리는 일회용 계량 보트에 올려 놓습니다. 뇌 조직이 담긴 계량 보트를 드라이아이스가 담긴 폴리스티렌 용기에 자주 넣어 조직이 해동되지 않도록 주의하십시오. 필요한 모든 조직 조각을 해부하고 무게를 측정한 후 드라이아이스에서 조직 조각이 들어 있는 계량 보트를 꺼냅니다.

다음으로, 조직 그램당 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일이 포함된 얼음처럼 차가운 저염 완충액 5밀리리터를 첨가하고, 약 10스트로크의 고클리어런스 유봉 A와 15스트로크의 저클리어런스 유봉 B를 사용하여 얼음 위에서 균질화합니다. 그런 다음 9인치 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 균질을 라벨이 붙은 2밀리리터 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 남은 균질을 섭씨 -80도에서 보관하기 위해 유사한 방식으로 라벨이 부착된 추가 1.5밀리리터 튜브에 분취합니다.

분별을 진행하려면 각 0.8mm 분취량에 100마이크로리터의 5몰 염화나트륨과 100마이크로리터의 10% 사르코실을 첨가합니다. 반전으로 잘 섞은 다음 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 마이크로 팁 프로브가 장착 된 초음파 발생기를 사용하여 30 % 진폭으로 3 개의 5 초 펄스를 전달합니다.

비신코닌산 방법을 사용하여 균질산의 단백질 농도를 결정한 후, 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 사크 완충액을 각 샘플에 밀리미터당 10밀리그램의 최종 농도로 첨가합니다. 그런 다음 각 샘플 500마이크로리터를 500마이크로리터 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브로 옮깁니다.

튜브를 미리 냉각된 로터에 넣고 섭씨 4도에서 30분 동안 180,000배 g으로 초원심분리합니다. 원심분리 후 S1 사르코실 가용성 상청액을 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 -80도에서 보관합니다. 세제 불용성 P1 분획물이 들어 있는 초원심분리기 튜브에 200마이크로리터의 사크 완충액을 추가하고 피펫 팁을 사용하여 초원심분리기 튜브 바닥에서 펠릿을 제거합니다.

다음으로, 재현탁된 P1 펠릿을 새로운 500마이크로리터 초원심분리기 튜브로 옮기고, 쌍을 이루고, 섭씨 4도에서 추가로 30분 동안 180,000배 g에서 원심분리합니다. S2 상청액을 버린 다음 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일이 포함된 요소 완충액 50-75마이크로리터를 사르코실 불용성 펠릿에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하여 P2 펠릿을 가용화합니다.

배양 후, 재현탁 된 P2 펠릿을 표지된 0.5mm 튜브로 옮기고 20 % 진폭에서 짧은 1 초 마이크로 팁 초음파 처리를 사용하여 펠릿을 완전히 가용화합니다. BCA 분석 방법을 사용하여 사르코실 가용성 및 사르코실 불용성 분획의 단백질 농도를 결정합니다.