쥐 해마 절편에서 중간뉴런의 면역염색

비오틴 접합 분자인 바이오시틴으로 채워진 인터뉴런을 포함하는 고정된 쥐 해마 절편을 가져 와십시오.

다음으로, 차단 단백질과 비이온성 세제가 포함된 용액을 첨가하여 비특이적 결합을 방지하고 뉴런을 투과시킵니다.

중간 뉴런의 특정 칸나비노이드 수용체를 표적으로 하는 1차 항체와 함께 배양합니다.

과도한 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

그런 다음 스트렙타비딘 접합 형광 염료와 형광단 접합 2차 항체를 추가합니다.

배양하는 동안 스트렙타비딘은 바이오시틴에 강하게 결합하여 바이오시틴으로 채워진 중간 뉴런을 시각화할 수 있는 반면, 2차 항체는 중간 뉴런의 수용체 결합 1차 항체를 표적으로 합니다.

완충액으로 헹구고 결합되지 않은 분자를 제거합니다.

이제 수성 마운팅 매체를 사용하여 섹션을 장착합니다. 커버슬립을 배치하고 밀봉합니다.

형광 현미경을 사용하여 바이오사이틴으로 채워진 중간 뉴런 및 칸나비노이드 수용체 발현을 시각화하여 중간 뉴런의 형태 및 수용체 분포를 분석할 수 있습니다.

실온에서 1시간 동안 10% 차단 세럼으로 조직을 잠급니다. 그 후, 1차 항체 CB1R의 절편을 실온에서 밤새 배양하여 칸나비노이드 수용체 유형 1 발현을 식별합니다. 그런 다음 뇌 절편을 0.1몰 PBS에서 각각 10분 동안 세 번 세척합니다. 스트렙타비딘과 제1 1차 항체에 대한 2차 항체를 모두 웰 플레이트에 첨가하고 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다.

그 후, 스트렙타비딘 적색 염료 접합체에서 절편을 암울한 곳에서 밤새 밤새 배양하여 바이오시틴을 드러냅니다. 그 후, 뇌 절편을 0.1몰 PBS에서 각각 10분 동안 3회 세척합니다. 형광을 보호하고 향후 재염색을 용이하게 하려면 수성 기반 마운팅 매체에 섹션을 장착하고 커버슬립의 가장자리를 투명한 매니큐어로 밀봉합니다.