Drosophila 유충에서 고출력 레이저를 사용하여 표적 신경 손상 유도

마취된 초파리 유충을 진공 그리스 반점이 있는 유리 슬라이드의 기름 방울 위에 머리를 위로 올려 놓습니다.

커버슬립을 놓고 부드럽게 눌러 유충과 접촉합니다.

유충을 조정하여 형광 단백질을 발현하는 표적 뉴런을 포함하는 영역을 노출시킵니다.

슬라이드를 2광자 현미경에 고정합니다.

저출력 레이저를 사용하여 손상을 최소화하고 유충을 스캔하여 형광 표적 뉴런이 있는 영역을 찾습니다.

다음으로, 스캔 창을 조정하여 신경 돌기의 일종인 축삭이 포함된 대상 영역에 초점을 맞춥니다.

이제 스캔 속도를 줄이고 레이저 출력을 높이십시오.

고출력 레이저는 표적 축삭을 공격하여 국부적인 열을 발생시켜 축삭을 손상시키고 손상 부위 주변의 형광을 향상시킵니다.

마지막으로 저전력 레이저 모드로 다시 전환합니다. 손상 부위에 작은 분화구, 고리 모양의 구조가 존재하면 성공적인 신경 손상이 확인됩니다.

유충을 마취하는 것부터 시작하십시오. 연기 후드에 60mm 유리 접시를 15cm 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 티슈 페이퍼를 접어 유리 접시에 담습니다. 디에틸 에테르를 첨가한 후 포도 한천 플레이트를 조직 위에 놓습니다. 그런 다음 유리 슬라이드 위에 할로카본 27 오일 한 방울을 중앙에 놓고 네 모서리 각각에 진공 그리스 한 점을 놓습니다.

그런 다음 집게를 사용하여 유충 한 마리를 한천 접시에 옮기고 유리 접시를 덮어 유충을 마취합니다. 유충이 움직이지 않으면 머리를 똑바로 세운 채 할로카본 오일에 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 슬라이드 위에 커버슬립을 놓고 유충에 닿을 때까지 부드럽게 누릅니다. 다음으로, 부드러운 힘을 사용하여 커버슬립을 밀어 절제할 세포를 두 광자 레이저가 가장 쉽게 닿을 수 있는 곳으로 굴립니다. 위치는 표적이 되는 뉴런에 따라 달라집니다.

이제 2광자 현미경 스테이지에서 어셈블리를 고정하고 40x 오일 침지 대물렌즈를 사용하여 관심 세포에 초점을 맞춥니다. 소프트웨어에서 스캔 모드로 전환하고 저장된 프로토콜을 로드합니다. 핀홀이 완전히 열려 있는지 확인하십시오. 그런 다음 라이브 모드에서 관심 지역의 좋은 이미지를 얻습니다. 그런 다음 라이브 스캔을 중지하여 자르기 버튼을 사용할 수 있습니다. 자르기 기능을 사용하여 스캔 창을 조정하여 대상 영역을 부상 부위에만 집중시킵니다.

그런 다음 새 이미징 창을 엽니다. 이제 스캔 속도를 줄이고 레이저 강도를 높입니다. 그런 다음 연속 버튼을 전환하여 스캔을 시작하고 중지합니다. 주의 깊게 관찰하십시오. 형광이 급격히 증가하면 스캔을 종료하십시오. 그런 다음 원래 이미징 창으로 다시 전환하고 라이브 모드를 선택하고 초점을 조정하여 방금 대상으로 한 영역을 찾습니다.

성공적인 부상의 좋은 징후는 부상 부위에 작은 분화구, 고리 모양의 구조 또는 국부적인 파편이 나타나는 것입니다. 레이저 출력이 너무 높으면 큰 피해 영역이 표시되어 치명적일 수 있습니다.