타우 단백질 응집 분석을 위한 인간 뉴런의 렌티바이러스 매개 형질도입

매트릭스 코팅 플레이트에서 성숙한 인간 뉴런의 부착 배양으로 시작합니다.

황색 형광 단백질(YFP) 리포터에 융합된 돌연변이 인간 타우 단백질을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 추가합니다.

렌티바이러스는 특정 신경 세포 표면 수용체에 부착하여 바이러스-숙주 막 융합과 바이러스 RNA 및 효소의 방출을 가능하게 합니다.

바이러스 RNA는 DNA로 역전사됩니다.

바이러스 인테그라제는 DNA를 핵으로 운반하여 숙주 게놈으로의 통합을 촉진하고 YFP 태그 돌연변이 타우 단백질의 생산을 유도합니다.

시간이 지남에 따라 돌연변이 타우는 형질도입된 세포에서 세포질 응집체를 형성합니다.

내

재되지 않은 바이러스 입자를 제거하기 위해 신선한 배지로 세포를 세척합니다.

뉴런 생존력을 유지하고 단백질 응집을 촉진하기 위해 정기적인 배지 교체와 함께 배양을 계속합니다.

현미경으로 뉴런을 시각화합니다.

성공적으로 형질도입된 뉴런은 형광 YFP 태그 돌연변이 타우 단백질의 세포질 응집체를 나타냅니다.

렌티바이러스로 뉴런을 형질도입하려면 세포당 340,000 형질도입 가능한 단위의 역가 수를 사용합니다. 세포 배양 배지에서 형질도입 가능한 단위를 필요한 농도로 희석하고 세포에 첨가합니다.

렌티바이러스를 첨가한 지 2일 후, bFGF를 포함하지 않는 신선한 배지로 세포를 한 번 세척합니다.

bFGF가 없는 배지에서 5% 이산화탄소로 섭씨 37도에서 세포를 계속 배양합니다. 형질도입 후 약 8주 동안 세포를 유지하고, 격일로 세포 배양 배지를 교체해야 합니다. 광학 현미경을 사용하여 세포를 일상적으로 시각화하고 생존력을 보장합니다.