인간 세포에서 γ-Secretase 활성을 측정하기 위한 Luciferase 분석

성장 배지에서 유전자 변형 인간 세포로 시작합니다.

이 세포에는 아밀로이드 전구체 단백질 또는 APP 유전자와 루시페라제 유전자를 소유한 테트라사이클린 유도 시스템이 포함되어 있습니다.

테트라사이클린을 함유한 배지와 교환하고 배양합니다.

테트라사이클린은 APP 프로모터에 결합하는 활성제 단백질에 결합합니다.

이것은 유전자 발현을 유도하고 세포막에 국한되는 전구체 단백질을 생성합니다.

β-세크레타제 효소는 APP를 절단하여 세포막에 부착된 상태로 남아 있는 단편을 생성합니다.

γ-세크레타제는 이 단편을 절단하여 아밀로이드-β 펩타이드를 생성하고 활성제 성분을 방출합니다.

이 활성제는 핵에 들어가 루시페라아제 프로모터에 결합하여 유전자 발현을 유도하고 루시페라아제 효소를 생성합니다.

배지를 루시페라제 기질을 포함하는 분석 시약으로 교체합니다. 기질은 세포 안으로 확산되고 루시페라아제와 반응하여 생물발광을 생성합니다.

마이크로플레이트 리더를 사용하여 신경병리학적 상태에 중요한 효소인 γ-세크레타제 활성을 직접 반영하는 광도를 측정합니다.

혈구계로 NG 또는 CG 세포를 계산합니다. 그런 다음 성장 배지에서 웰당 200마이크로리터의 최종 부피로 웰당 200개의 세포를 96웰 마이크로플레이트에 시딩합니다. 마이크로플레이트를 가습된 이산화탄소 인큐베이터로 옮기고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 각 웰에서 100마이크로리터의 성장 배지를 제거합니다.

0.2% 디메틸설폭사이드, 2마이크로몰 CL 387, 785, 2마이크로몰 DAPT 또는 기타 관련 ErbB1/ErbB2 억제제와 함께 테트라사이클린 밀리리터당 2마이크로그램을 포함하는 성장 배지의 웰당 100마이크로리터를 첨가한다. 처리된 세포를 섭씨 37도의 마이크로플레이트에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후, 마이크로플레이트에서 성장 배지의 웰당 150마이크로리터를 제거합니다.

그런 다음 루시페라아제 분석 시약의 웰당 50마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 마이크로플레이트를 발광 마이크로플레이트 리더로 옮기고 실온에서 5분 동안 유지합니다. 발광 마이크로플레이트 리더에 저장된 사전 정의된 프로그램을 사용하여 반딧불이 루시페라아제가 방출하는 발광을 결정합니다.