JoVE 실험 백과사전
신경과학
0 조회수 • 6:31 분 • July 8th, 2025
유전자 변형 마우스 배아에서 피질 중간 뉴런 전구세포를 포함하는 내측 신경절 융기 조직을 수확합니다.
양이온성 중합체를 첨가하고 조직을 단일 세포 현탁액으로 해리시킵니다.
lox 부위 옆에 있는 Cre 재조합효소 의존성 GFP 리포터를 운반하는 렌티바이러스 벡터를 추가합니다. 인큐베이트.
폴리머는 바이러스 및 숙주 세포막 전하를 중화하여 바이러스 융합 및 RNA 방출을 가능하게 합니다.
바이러스 RNA는 역전사되어 숙주 게놈에 통합됩니다.
원심분리하여 상청액을 버립니다. 과도한 매체를 흡수하십시오.
세포를 소수성 표면으로 옮기고 주입 장치에 로드합니다.
마취된 쥐 새끼의 피질에 세포를 주입합니다.
강아지가 회복되고 성장할 수 있도록 하십시오.
이식된 전구세포는 피질에서 성숙한 중간 뉴런으로 분화합니다.
이러한 중간 뉴런의 하위 그룹은 Cre 재조합 효소와 RFP를 공동 발현합니다.
이러한 중간 뉴런에서 Cre는 lox 부위를 절제하여 GFP 유전자를 뒤집고 발현을 가능하게 합니다.
RFP 및 GFP 공동 발현을 시각화하여 Cre 발현 인터뉴런을 식별합니다.
렌티바이러스를 준비하고 서면 프로토콜의 지시에 따라 MGE를 해부한 후 MGE의 양쪽 반구를 수집하고 조직을 10% FBS가 포함된 500마이크로리터의 DMEM이 들어 있는 2개의 1.5밀리리터 수집 튜브에 넣습니다.
모든 조직이 수집될 때까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 튜브를 BSL-2 인증 후드로 옮깁니다. 튜브 바닥에 침전된 MGE 조직을 방해하지 않고 배지를 조심스럽게 흡인합니다.
그런 다음 약 500마이크로리터의 예열된 DMEM을 10% FBS 배지와 함께 추가합니다. 폴리브렌을 밀리리터당 8마이크로그램의 최종 농도로 첨가하고 단일 세포 현탁액이 달성될 때까지 P1000 피펫 팁을 통해 적정합니다. 그런 다음 농축된 렌티바이러스 15-20마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다.
그런 다음 각 튜브를 단단히 닫고 거꾸로 혼합한 다음 모든 튜브를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. 세포를 렌티바이러스와 함께 최소 30분 동안 배양하되 시간이 길어지면 세포 생존력이 감소하므로 한 시간 이상 배양하지 마십시오. 10분마다 튜브를 뒤집습니다.
배양 후 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 섭씨 4도에서 700배 g으로 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. BSL-2 후드에서 상층액을 제거하고 10% 표백제에 버립니다. 다음으로, 10% FBS가 포함된 DMEM 1밀리리터를 첨가하고 펠릿을 2-3회 적정하여 세척합니다.
이전과 같이 원심분리한 후 이 세척 단계를 두세 번 더 반복하여 과도한 바이러스를 제거합니다. 최종 세척 후 가능한 한 많은 매체를 제거하고 각 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
튜브 측면의 잔류 배지로 인해 이식 절차가 시작될 때까지 약 2-3마이크로리터의 배지가 세포 펠릿을 덮게 됩니다. 전체적으로 멸균 기술을 사용하면서 미네랄 오일을 1밀리리터 주사기에 흡입한 다음 30.5게이지 바늘로 유리 피펫에 미네랄 오일을 완전히 채웁니다.
그런 다음 유리 피펫을 정위 고정 장치에 부착하고 플런저에 로드합니다. 유압 드라이브를 사용하는 조수와 함께 플런저를 유리 피펫의 절반 정도로 움직여 깨끗한 종이 타월로 쏟아지는 미네랄 오일을 제거합니다.
다음으로, 멸균 종이 타월의 모서리를 미세한 부분으로 비틀고 이를 사용하여 MGE 세포 펠릿 위의 여분의 배지를 섬세하게 제거합니다. 이렇게 하면 세포 밀도가 집중되어 더 작은 주입량을 얻을 수 있습니다.
다음으로, P2 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 천천히 끌어올리고 소수성 표면에 분배하기 전에 1-2회 적정합니다. 부피는 1마이크로리터 미만이어야 합니다.
바늘 끝을 세포 현탁액 안으로 이동하고 유압 드라이브를 사용하여 세포 현탁액을 피펫으로 끌어 올립니다. 저체온증으로 강아지를 마취한 후 겸자로 발가락 사이의 피부를 꼬집어 마취의 효과를 확인합니다. 반응이 나타나지 않아야 합니다.
그런 다음 강아지를 주입 장치 아래에 있는 틀에 놓고 머리의 피부를 뒤로 당긴 다음 표준 실험실 테이프로 고정하여 피부를 팽팽하게 만듭니다. 빠르게 작업하면서 정위 암을 조작하여 유리 피펫의 끝을 강아지의 머리 위에 머리 표면에 수직으로 배치합니다.
피펫이 헤드와 접촉하면 이를 0으로 간주합니다. 그런 다음 피펫을 피부와 두개골의 표면을 통해 피질로 밀어 넣습니다. 그런 다음 피펫을 두 번 삽입했다가 집어넣은 후 멈춥니다.
세포를 신피질로 표적으로 삼기 위해 마이크로피펫이 0.1mm 깊이에 있을 때 주사가 수행됩니다. 바늘이 제자리에 있으면 유압 장치를 회전시켜 플런저를 유리 피펫으로 전진시키고 부위당 50-70나노리터를 주입합니다.
신피질 전체에 형질전환된 세포의 광범위한 분포가 필요한 경우 서로 다른 주둥이-꼬리 수준에서 3-6개의 서로 다른 부위에서 이 절차를 반복합니다. 주사가 완료되면 스테이지에서 강아지를 제거하고 승인된 절차에 따라 표시합니다.
강아지가 회복되어 스스로 움직일 수 있게 되면 수유 중인 암컷과 나머지 새끼와 함께 다시 돌려주세요. 시술 후와 다음날 강아지를 점검하여 건강이 악화될 징후가 없
는지 확인하십시오.