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신경과학
0 조회수 • 6:31 분 • July 8th, 2025
유전자 변형 마우스 배아에서 피질 중간 뉴런 전구세포를 포함하는 내측 신경절 융기 조직을 수확합니다.
양이온성 중합체를 첨가하고 조직을 단일 세포 현탁액으로 해리시킵니다.
lox 부위 옆에 있는 Cre 재조합효소 의존성 GFP 리포터를 운반하는 렌티바이러스 벡터를 추가합니다. 인큐베이트.
폴리머는 바이러스 및 숙주 세포막 전하를 중화하여 바이러스 융합 및 RNA 방출을 가능하게 합니다.
바이러스 RNA는 역전사되어 숙주 게놈에 통합됩니다.
원심분리하여 상청액을 버립니다. 과도한 매체를 흡수하십시오.
세포를 소수성 표면으로 옮기고 주입 장치에 로드합니다.
마취된 쥐 새끼의 피질에 세포를 주입합니다.
강아지가 회복되고 성장할 수 있도록 하십시오.
이식된 전구세포는 피질에서 성숙한 중간 뉴런으로 분화합니다.
이러한 중간 뉴런의 하위 그룹은 Cre 재조합 효소와 RFP를 공동 발현합니다.
이러한 중간 뉴런에서 Cre는 lox 부위를 절제하여 GFP 유전자를 뒤집고 발현을 가능하게 합니다.
RFP 및 GFP 공동 발현을 시각화하여 Cre 발현 인터뉴런을 식별합니다.
렌티바이러스를 준비하고 서면 프로토콜의 지시에 따라 MGE를 해부한 후 MGE의 양쪽 반구를 수집하고 조직을 10% FBS가 포함된 500마이크로리터의 DMEM이 들어 있는 2개의 1.5밀리리터 수집 튜브에 넣습니다.
모든 조직이 수집될 때까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 튜브를 BSL-2 인증 후드로 옮깁니다. 튜브 바닥에 침전된 MGE 조직을 방해하지 않고 배지를 조심스럽게 흡인합니다.
그런 다음 약 500마이크로리터의 예열된 DMEM을 10% FBS 배지와 함께 추가합니다. 폴리브렌을 밀리리터당 8마이크로그램의 최종 농도로 첨가하고 단일 세포 현탁액이 달성될 때까지 P1000 피펫 팁을 통해 적정합니다. 그런 다음 농축된 렌티바이러스 15-20마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다.
그런 다음 각 튜브를 단단히 닫고 거꾸로 혼합한 다음 모든 튜브를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. 세포를 렌티바이러스와 함께 최소 30분 동안 배양하되 시간이 길어지면 세포 생존력이 감소하므로 한 시간 이상 배양하지 마십시오. 10분마다 튜브를 뒤집습니다.
배양 후 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 섭씨 4도에서 700배 g으로 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. BSL-2 후드에서 상층액을 제거하고 10% 표백제에 버립니다. 다음으로, 10% FBS가
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