$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
세포 접착을 촉진하기 위해 ECM 단백질로 코팅된 트랜스웰 인서트가 있는 마이크로플레이트를 가져갑니다.
인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)를 삽입물에 추가하고 성장 배지를 하부 구획에 추가합니다.
배양하여 세포가 부착되어 단층으로 성장할 수 있도록 합니다. 이 세포는 세포와 분자의 통과를 제한하는 혈액-뇌 장벽 내피를 모방하여 긴밀한 접합을 발현합니다.
매체를 제거합니다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 삽입물에 추가하고 배양 배지를 하부 구획에 추가합니다.
배양하여 PBMC 림프구가 내피 세포와 상호 작용한 다음 내피 세포 사이를 통과할 수 있도록 하는데, 이를 전위라고 합니다.
인서트 바닥을 헹구고 부착된 형질전환된 세포를 하부 구획으로 수집합니다.
세포 정량화를 위한 참조로 형광 마이크로비드를 도입합니다.
현탁액을 튜브로 옮기고, 원심분리하고, 상청액을 버리고, 형광단 접합 항체 칵테일에 재현탁하여 림프구를 표지합니다.
형편 이동된 림프구는 유세포 분석을 통해 정량화할 준비가 되어 있습니다.
전이 분석을 위해 세포 배양 삽입물을 준비하려면 먼저 각 삽입물과 96웰 평바닥 플레이트의 웰 1개에 100마이크로리터의 피브로넥틴 용액을 추가합니다. 섭씨 37도에서 3시간 후, 피브로넥틴 용액을 100마이크로리터의 HBMEC로 교체하고 600마이크로리터의 신선한 ECM-b 배지를 세포 배양 삽입물의 하부 구획에 추가합니다.
그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 3-4일 동안 되돌립니다. 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC 샘플을 B27이 보충된 RPMI 배지에서 밀리리터당 5배 10 내지 6 세포 농도로 재현탁합니다. 다음으로, 합류 HBMEC 단층을 포함하는 적절한 수의 세포 배양 인서트의 하부 및 상부 구획에서 배지를 흡인하고, 기증자당 100마이크로리터의 PBMC를 세포 배양 인서트에 추가하고, 시험관 내 대조군당 24웰 플레이트의 웰 1개에 첨가합니다.
600마이크로리터의 RPMI와 B27을 세포 배양 삽입물의 하부 구획에 추가하고 500마이크로리터를 시험관 내 대조군 웰에 추가하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 6시간 동안 되돌립니다. 배양이 끝나면 집게를 사용하여 세포 배양 삽입물을 제거하고 멤브레인을 건드리지 않고 400마이크로리터의 PBS로 바닥을 조심스럽게 헹구습니다.
그런 다음 20마이크로리터의 유량 계수 형광구를 실험 및 시험관 내 대조군 웰의 세포와 완전히 혼합하고 생성된 PBMC 현탁액 1밀리리터를 적절한 해당 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 세포를 수집하고 100마이크로리터의 유세포 분석 완충액에 관심 있는 형광색소 접합 항체를 각 샘플에 첨가합니다. 섭씨 4도에서 30분 후, 250마이크로리터의 신선한 유세포 분석 완충액으로 세포를 세척하고 분석을 위해 적절한 부피의 유세포 분석 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.