방사성 표지된 도파민을 사용하여 마우스 뇌 시냅토솜에서 도파민 흡수 측정

도파민 수송체(DAT)를 포함하는 신경 시냅스의 온전한 시냅스 전 말단에서 파생된 막 결합 구조인 시냅토좀을 마우스 뇌에서 수확합니다.

시험관에 리간드를 함유한 완충액을 채우고 기준 튜브에 리간드를 함유한 완충액과 DAT 억제제를 채웁니다.

시냅토좀을 추가합니다.

리간드는 도파민 분해 효소 및 기타 수송체를 억제하여 도파민 분해 및 비특이적 흡수를 방지합니다.

표지되지 않은 도파민과 방사성 표지된 도파민을 도입합니다.

테스트 조건에서 시냅토솜 DAT는 도파민을 흡수합니다.

참조 조건에서 억제제는 DAT 매개 도파민 흡수를 방지하여 배경 흡수만 허용합니다.

시냅토좀을 유지하는 극세사 필터에 샘플을 추가합니다.

결합되지 않은 도파민을 제거하기 위해 씻으십시오.

필터를 섬광관으로 옮깁니다.

방사선에 민감한 화합물을 포함하는 섬광유를 추가합니다.

튜브를 섬광 카운터에 놓습니다.

도파민의 방사성 방출은 화합물을 자극하여 빛을 방출하며, 이는 카운터에 의해 측정됩니다.

시냅토솜 도파민 흡수를 측정하기 위해 테스트 데이터에서 참조를 뺍니다.

이 단계에서, 440마이크로리터의 흡수 완충액, 리간드 및 코카인을 12개의 지정된 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브에 추가하고, 440마이크로리터의 흡수 완충액 및 리간드를 나머지 36개의 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브에 첨가한다. 6개의 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 및 0.31로 라벨을 붙입니다. 그런 다음 750마이크로리터의 흡수 완충액과 리간드를 가장 낮은 수의 5개의 미세 원심분리기 튜브에 추가합니다.

다음으로, 1,455.4마이크로리터의 흡수 완충액 및 리간드, 14.6마이크로리터의 표지되지 않은 도파민, 30마이크로리터의 삼중수화 도파민을 10으로 표지된 튜브에 첨가합니다. 다음으로, 750마이크로리터의 혼합물을 10으로 표시된 튜브에서 5로 표시된 튜브로 옮깁니다. 잘 섞고 이 튜브에서 750마이크로리터의 혼합물을 2.5라고 표시된 튜브로 옮깁니다. 나머지 튜브로 이 희석을 반복합니다.

그런 다음 유리 극세사 필터를 12웰 필터 버킷에 놓은 후 4밀리리터의 흡수 완충액으로 미리 헹굽니다. 그 후, 시냅토솜 막 현탁액 10마이크로리터를 440마이크로리터 완충액을 포함하는 처음 24개의 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 첨가합니다. 조심스럽게 소용돌이치고 시냅토좀이 버퍼에 잠

기도록 잠시 회전합니다.

그런 다음 섭씨 37도에