쥐 뇌 절편에서 RNA 발현을 연구하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 현장 혼성화

로토닌 증후군이 있는 쥐의 고정된 뇌 절편을 채취하여 뉴런에서 세로토닌 수용체 RNA 합성을 변경합니다.

알코올을 사용하여 조직을 탈수합니다. 전처리 용액을 적용하여 내인성 가수분해 효소를 비활성화하여 검출 시약과의 상호 작용을 방지합니다.

끓는 완충액으로 처리하여 고정 유도 가교를 끊고 표적 RNA를 노출시킵니다.

조직을 탈수하고 소수성 장벽을 그린 다음 용액과 함께 배양하여 세포막을 투과시킵니다.

올리고뉴클레오티드 프로브를 추가하고 인큐베이팅하여 프로브가 표적 RNA와 혼성화되도록 합니다.

결합되지 않은 프로브를 제거하기 위해 세척한 다음 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합하는 프리앰프, 증폭기 및 효소 접합 라벨 프로브를 포함하는 증폭 시약과 함께 배양합니다.

효소 접합 프로브에 의해 가수분해되어 눈에 보이는 색상을 생성하는 발색 기질과 함께 배양합니다.

자일렌으로 처리하여 조직 투명도를 높이고 설치 배지를 추가하고 커버슬립을 도포합니다.

현미경으로 보면 조직의 유색 반점이 표적 RNA 발현을 정량화하는 데 도움이 됩니다.

이 절차에서는 탈수를 위해 섭씨 영하 80도 냉동고에 보관된 현미경 슬라이드 박스용 슬라이드 4개를 가져갑니다. ppiB, dapB 및 ht2a 유전자 테스트에 섹션을 할당합니다. 볼펜으로 표시하고 라벨을 붙입니다.

그런 다음 슬라이드를 실온에서 100% 알코올에 5분 동안 담그십시오. 그런 다음 히트를 후드에서 5분 동안 건조시킵니다. 전처리를 위해 전처리 20마이크로리터를 각 섹션에 하나의 시약을 피펫팅합니다.

슬라이드를 수분 트레이의 랙 레일에 놓습니다. 수평 셰이커에서 수분 트레이를 저속으로 10분 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 슬라이드를 이중 증류수로 2분 동안 두 번 씻습니다. 슬라이드를 450밀리리터의 전처리 2 시약이 들어 있는 1,000밀리리터 비커에 담그십시오.

그런 다음 슬라이드를 섭씨 100도에서 총 5분 동안 끓여 RNA 구조를 복원합니다. 그런 다음 슬라이드를 이중 증류수로 매번 2분 동안 두 번 세척합니다. 슬라이드를 100% 알코올에 5분 동안 담가둡니다.

그런 다음 휘관 후드에서 슬라이드를 5분 동안 건조시킵니다. 소수성 펜을 사용하여 조직 섹션에서 선택한 영역 주위에 원을 그립니다. 그런 다음 10마이크로리터의 전처리 시약을 선택한 각 영역에 피펫으로 삽입하여 프로브 침투를 높이고 수분 트레이를 뚜껑으로 덮습니다.

그런 다음 수평 셰이커가 장착된 하이브리드화 오븐에 트레이를 놓습니다. 오븐 온도를 섭씨 40도로 설정하고 트레이를 30분 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 슬라이드를 이중 증류수로 매번 2분 동안 두 번 세척합니다.

이 단계에서는 선택한 영역에 10마이크로리터의 ppiB, dapB 또는 htr2a 프로브를 피펫팅합니다. 그런 다음 시약이 증발하지 않도록 수분 트레이를 뚜껑으로 덮습니다. 수평 셰이커의 슬라이드를 저속으로 부드럽게 흔들면서 오븐에서 섭씨 40도에서 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 슬라이드를 세척 완충액으로 매번 2분 동안 두 번 세척합니다. 선택한 각 영역에 증폭 1 시약 10 마이크로리터를 피펫팅합니다. 슬라이드를 흔들고 섭씨 40도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 슬라이드를 세척 완충액으로 매번 2분 동안 두 번 세척합니다.

선택한 각 영역에 증폭 2 시약 10마이크로리터를 피펫팅합니다. 슬라이드를 흔들어 섭씨 40도에서 15분 동안 배양합니다. 그 후, 슬라이드를 세척 완충액으로 매번 2분 동안 두 번 세척합니다.

선택한 각 영역에 증폭 3 시약 10마이크로리터를 피펫팅합니다. 슬라이드를 흔들고 섭씨 40도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 슬라이드를 세척 완충액으로 2분 동안 두 번 세척합니다.

선택한 각 영역에 증폭 4 시약 10마이크로리터를 피펫팅합니다. 슬라이드를 흔들어 섭씨 40도에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 슬라이드를 세척 완충액으로 2분 동안 두 번 세척합니다.

선택한 각 영역에 증폭 5 시약 10마이크로리터를 피펫팅합니다. 슬라이드를 흔들어 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 슬라이드를 세척 완충액으로 2분 동안 두 번 세척합니다.

선택한 각 영역에 증폭 6 시약 10마이크로리터를 피펫팅합니다. 슬라이드를 흔들고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 슬라이드를 세척 완충액으로 매번 2분 동안 다시 두 번 세척합니다.

이제 선택한 각 영역에 10마이크로리터의 빨간색 시약을 피펫팅합니다. 슬라이드를 수평 셰이커의 수분 트레이에 실온에서 놓고 저속으로 10분 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 슬라이드를 이중 증류수로 매번 10분 동안 두 번 세척합니다.

슬라이드를 오븐에서 섭씨 60도에서 15분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 슬라이드를 자일렌에 담근 후풍에 5분 동안 놓습니다. 그런 다음 선택한 각 영역에 20마이크로리터의 자일렌 기반 마운팅 매체를 피펫팅하고 커버슬립으로 덮습니다.