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신경과학
0 조회수 • 4:11 분 • July 8th, 2025
대조군과 돌연변이 초파리 유충을 포도당이 없는 완충액이 들어 있는 별도의 접시에 넣습니다.
유충을 해부하여 내부 장기를 제거하고 중추신경계 또는 CNS를 노출시킵니다.
CNS에는 운동 뉴런이 있는 복부 신경줄이 포함됩니다. 돌연변이 유충에서 이러한 뉴런은 상향 조절된 포도당 대사를 나타냅니다.
두 그룹의 운동 뉴런은 기증자 및 수용체 형광단을 포함하는 세포내 포도당 센서를 발현합니다.
공초점 현미경 아래에 유충을 배치합니다. 여기되면 기증자 형광단은 형광을 방출합니다.
이 형광을 사용하여 운동 뉴런을 찾습니다.
완충액을 포도당 보충 용액으로 교체하십시오.
포도당은 뉴런으로 들어가 센서에 결합하고 두 형광단을 근접시키는 구조적 변화를 유발합니다.
여기 시 수용체는 형광 공명 에너지 전달 또는 FRET라고 하는 기증자가 방출하는 에너지를 흡수하고 형광을 방출합니다.
FRET 신호는 포도당 흡수와 상관관계가 있습니다. 대조군에 비해 돌연변이 유충에서 더 높은 수용체 신호 강도는 포도당 대사가 상향 조절되었음을 나타냅니다.
해부를 시작하기 전에 이미징 현미경과 레이저를 켜십시오. 그런 다음 방황하는 3령 유충을 수집하세요. 이중 증류수로 헹구고 미리 준비된 엘라스토머 라이닝 접시에 HL3 완충액 한 방울에 넣습니다.
다음으로, 해부 현미경으로 한 쌍의 집게를 사용하여 곤충 핀으로 유충을 세로로 조심스럽게 늘려 유충의 앞쪽과 뒤쪽 끝을 등쪽이 위로 향하게 고정합니다. 각진 홍채 가위를 사용하여 후방 핀 바로 위에 절개를 합니다. 그런 다음 절개 부위에서 유충의 앞쪽 끝을 향해 수직으로 절단합니다.
HL3 완충액 몇 방울을 추가한 후 필요한 경우 중추신경계를 방해하지 않고 기관과 나머지 부유 기관을 제거합니다. 그런 다음 플랩을 고정하여 체벽을 늘려 신경근계를 손상되지 않은 상태로 유지하면서 중추 신경계를 노출시킵니다.
이미지 획득을 위해 40배 수침 렌즈가 있는 정립 공초점 현미경을 사용하십시오. 그런 다음 405나노미터 레이저를 선택하여 CFP를 여기시킵니다. 다음으로, 스캔 속도, 평균, 목표, 확대/축소 핀홀 크기, 공간 해상도 등의 획득 매개변수를 최적화합니다. 신호가 최적의 동적 범위에 있도록 이득을 조정하고 모든 유전자형에 대해 동일한 매개변수를 사용합니다.
복부 신경 코드 내의 운동 뉴런을 이미지화하려면 해부된 샘플이 담긴 실리콘 접시를 렌즈 아래에 놓고 렌즈를 내려 트레할로스 자당 HL3와 접촉하도록 합니다. 렌즈가 버퍼에 완전히 잠겼는지 확인하고 필요한 경우 버퍼를 더 추가합니다.
다음으로, CFP 및 FRET 채널을 사용하여 복부 신경줄 정중선을 따라 위치한 초점이 맞춰진 최소 6개의 운동 뉴런으로 구성된 광학 선택을 수동으로 선택합니다. 그런 다음 10초 또는 10분마다 이미지를 획득합니다. 이러한 이미지는 기준선을 나타냅니다.
포도당 자극을 위해 파스퇴르 피펫을 사용하여 HL3 완충액을 함유한 트레할로스 자당을 제거하고 복부 신경줄을 움직이지 않고 5밀리몰 포도당 보충 HL3 완충액을 추가합니다. 그런 다음 10분 동안 10초마다 이미지를 획득합니다.
이 이미지는 자극 단계를 나타냅니다. 이미지를 dot czi 파일 또는 날짜, 유전적 배경, 실험 조건 및 사용된 채널을 포함한 파일 이름으로 이미징 소프트웨어에서 지원하는 모든 파일 형식으로 저장합니다. 매개변수를 재사용하여 모든 유전자형을 이미지화했습니다.